【正文】 第二部分 微生物的代謝 ? 生物大分子降解為小分子 ? 代謝中間體 丙酮酸 ? TCA環(huán) ? 發(fā)酵與呼吸 ? 代謝中能量的釋放與利用 ? 合成代謝 ? 次級(jí)代謝與調(diào)節(jié) ? 代謝控制發(fā)酵 ? 發(fā)酵工藝基礎(chǔ)知識(shí) 生物大分子分解 微生物發(fā)酵基質(zhì)主要包括淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠、核酸、脂類等 淀粉 淀粉酶 液化型 糖化型 （ a淀粉酶） 葡糖生成酶 223。淀粉酶 異淀粉酶 葡萄糖 （淀粉 1， 4葡萄糖苷酶） （淀粉 1， 6葡萄糖苷酶） （淀粉 1， 4麥芽糖苷酶） 工業(yè)上常用的碳源（ carbon source） （玉米、馬鈴薯、木薯淀粉） — 應(yīng)用最廣。 使用條件： 微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類。 缺點(diǎn)： 、發(fā)酵液比較稠、一般 %時(shí)加入 一定的 α 淀粉酶。 ，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等。 優(yōu)點(diǎn)： 來源廣泛、價(jià)格低，可解除葡萄糖效應(yīng)。 2. 葡萄糖 ?所有的微生物都能利用葡萄糖，但會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)。 ?工業(yè)上常用淀粉水解糖 ,但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)。 DE值： dextrose equivalent value （葡萄糖當(dāng)量值） 表示淀粉糖的含糖量。 還原糖含量（％） DE值＝ ? 100％ 干物質(zhì)含量（％） 淀粉水解糖的制備方法及原理 （一）酸解法（ acid hydrolysis method） 以酸為催化劑，在高溫高壓下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。 ： 總反應(yīng)式： (C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6 過程： (C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6 淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖 H+對(duì)作用點(diǎn)無選擇性， ?1,4糖苷鍵和 ?1,6糖苷鍵均被切斷。 ? 評(píng)價(jià) ? 優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，設(shè)備周轉(zhuǎn)快。 ? 缺點(diǎn)： ? （ 1）副產(chǎn)物多，影響糖液純度，一般 DE值只有 90％左右。 ? （ 2）對(duì)淀粉原料要求嚴(yán)格，不能用粗淀粉，只能用純度較高的精制淀粉。 淀粉 葡萄糖 復(fù)合二糖 5‘－羥甲基糠醛 復(fù)合低聚糖 有機(jī)酸、有色物質(zhì) 損失葡萄糖量 7％ 1％ 復(fù)合反應(yīng) 分解反應(yīng) 鹽酸 酶解法 （ enzyme hydrolysis method） 用專一性很強(qiáng)的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。 分兩步： （ 1） 液化： 用 ?淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精和低聚糖（ 2）糖化：用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將糊精 和低聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。 所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下進(jìn)行，又稱雙酶法 (double enzyme hydrolysis method)。 （ liquification） ?－淀粉酶水解底物內(nèi)部的 ?－ 1,4糖苷鍵，不能水解 ?－ 1,6糖苷鍵，一般采用耐高溫淀粉酶，使液化速度加快。 85－ 90度 。 液化程度的控制（液化后需糖化的原因） a. 糖液的 DE值低（ α 淀粉酶不能水解 α 1,6糖苷鍵） b. 液化在較高溫度下進(jìn)行，液化時(shí)間加長(zhǎng)，淀粉老化，使糖化酶難以利用。 c. 糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范圍。 根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)， DE值在 20?30之間為好，液化終點(diǎn)可通過碘液判斷，此時(shí)呈棕色。 2. 糖化（ saccharification） 糖化酶從非還原性末端水解 ?1,4糖苷鍵和 ?1,6糖苷鍵。 終點(diǎn)確定： DE值達(dá)最高時(shí)，停止酶反應(yīng)。 優(yōu)點(diǎn) ： （ 1）反應(yīng)條件溫和，不需高溫、高壓設(shè)備。 （ 2）副反應(yīng)少，水解糖液純度高。 （ 3）對(duì)原料要求粗放，可用粗原料并在較高淀粉乳濃 度下水解。 （ 4）糖液顏色淺，質(zhì)量高。 缺點(diǎn)： （ 1）生產(chǎn)周期長(zhǎng)，一般需要 48小時(shí)。 （ 2）需要更多的設(shè)備，且操作嚴(yán)格。 （三）酸酶結(jié)合法 （ acidenzyme hydrolysis method） 集酸解法和酶解法的優(yōu)點(diǎn)而采取的生產(chǎn)工藝。根據(jù)原料淀粉性質(zhì)分： ：先將淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶將其水解為葡萄糖。 適用：淀粉顆粒堅(jiān)硬（如玉米、小麥）的原料，若用 ?淀粉酶液化，短時(shí)間液化，反應(yīng)往往不徹底 。 ：先用 ?淀粉酶液化，再用酸水解。 適用：顆粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，則水解不均勻。 （四）不同糖化工藝的比較 項(xiàng)目 酸解法 酸酶結(jié)合法 酶解法 DE值 91 95 98 羥甲基糠醛（％） 色度 10 淀粉轉(zhuǎn)化率 90 95 98 工藝條件 高溫加壓 高溫加壓 常溫 過程耗能 多 多 少 副產(chǎn)物 多 中 少 生產(chǎn)周期 短 中 長(zhǎng) 設(shè)備規(guī)模 小 中 大 防腐要求 高 較高 低 適合發(fā)酵工藝情況 差 中 有利 2. 纖維素的降解 纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，占地球總生物量的 40%，它也是地球生物圈碳素和能量循環(huán)的主要部分。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又被木質(zhì)素層包圍著，要把它水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難，所以到目前為止仍沒有得到很好地利用。 近幾年隨著原油價(jià)格的不斷攀升，纖維素資源的利用引起了世界各國的極大關(guān)注和高度重視。我國出于對(duì)能源戰(zhàn)略的考慮，近幾年也加大了對(duì)纖維素利用的研究的投入。 （ 1）纖維素的結(jié)構(gòu) 天然纖維素是由 D吡喃式葡萄糖通過 β 1,4糖苷鍵結(jié)合形成的線形長(zhǎng)鏈分子，約由 700150,000個(gè)左右的殘基所構(gòu)成，一般在 3000個(gè)左右。 通過分子間的氫鍵 (O3H?O5’ and O6 ? HO2’) 和分子鏈間的氫鍵 (O6H ? O3’) 形成網(wǎng)狀平面 并通過疏水面的堆積構(gòu)成纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。 O3H?O5’ O6 ? HO2’ O6H ? O3‘ 天然纖維素除了我們上面提到的結(jié)晶結(jié)構(gòu)外，還有非結(jié)晶區(qū)。如下圖。 結(jié)晶區(qū) 無定形區(qū) 微生物降解纖維素的酶系 降解和利用水不溶性的纖維素，微生物必須產(chǎn)生相應(yīng)的酶。在過去二十幾年里，根據(jù)酶對(duì)纖維素作用方式的研究，將纖維素降解的酶類分成三類： (i) 纖維素內(nèi)切酶 [endoglucanases or 1,4Dglucan4glucanohydrolases (EC )] (ii) 纖維素外切酶 [exoglucanases, including 1,4Dglucan glucanohydrolases (also known as cellodextrinases) (EC ) and 1,4—Dglucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases) (EC )] (iii) 葡萄糖苷酶 [glucosidases or glucoside glucohydrolases ().] 纖維素內(nèi)切酶隨機(jī)在纖維素的無定形區(qū)將糖鏈切斷，產(chǎn)生新的鏈端。纖維素外切酶作用于纖維素鏈的兩端產(chǎn)生纖維二糖。葡萄糖苷酶降解纖維素湖精和纖維二糖為葡萄糖。 教材上也將纖維素酶分為三種 C1酶、 CX酶及 223。葡萄糖苷酶 天然纖維素 短鏈纖維素 葡萄糖 纖維二糖 纖維寡糖 纖維二糖 葡萄糖 C1酶 CX酶 223。葡萄糖苷酶 by Small Angle Xray Scattering. . Vol. 277 pp. 40887–40892, 2022 纖維素酶的結(jié)構(gòu)可以分成三個(gè)部分：催化結(jié)構(gòu)域、吸附結(jié)構(gòu)域和連接肽。 纖維素酶對(duì)纖維素的作用是一個(gè)識(shí)別、吸附和催化的過程。 纖維素酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理 果膠 ? 半乳糖醛酸以 a1， 4糖苷鍵形成的直鏈高分子化合物， ，常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側(cè)鏈，游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子，特別是與硼化合物結(jié)合在一起 75%羧基甲基化成甲酯 從廣義上講，果膠酶可以被分為 3種類型：①原果膠酶：可以把不溶于水的原果膠分解為可溶于水的高聚合體果膠；②果膠甲酯水解酶：脫去果膠中的甲氧基基團(tuán)，促使果膠的脫甲酯作用；③果膠聚半乳糖醛酸（解聚酶）：促使果膠中D半乳糖醛酸的 α1， 4糖苷鍵的裂解。 目前國內(nèi)外研究和應(yīng)用較多的果膠酶產(chǎn)生菌是細(xì)菌和霉菌，也有鏈霉菌產(chǎn)生果膠酶的報(bào)道。在細(xì)菌中，歐文氏桿菌 (Erwinia sp.)、芽孢桿菌 (Bacillus sp.)、節(jié)桿菌 (Arthrobacter sp.)和假單胞桿菌 (Pseodomonas sp.)都產(chǎn)生果膠酶。嗜堿性芽孢桿菌屬和歐文氏桿菌屬主要用于在苧麻和紅麻的脫膠、生物制漿及污物的處理軟化等方面，應(yīng)用前景可觀，受到較多的關(guān)注和研究。已見報(bào)道的產(chǎn)果膠酶的霉菌種類大約包括 20個(gè)屬， 如曲霉屬 (Aspergillus sp.)、灰霉菌屬 (Botrytis sp.)、鐮孢菌屬(Fusarium sp.)、炭疽菌屬 (Colletotrichum sp.)、核盤菌屬 (Scletorium sp.)和玉圓斑菌屬 (Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾殼霉作為產(chǎn)果膠酶的菌株已經(jīng)商品化。國內(nèi)外對(duì)霉菌發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究主要集中在曲霉屬中，而曲霉屬中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果膠酶被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如用于果汁、果酒及中藥營養(yǎng)液的深加工等，使得產(chǎn)品質(zhì)量和外觀得以改善，而生產(chǎn)食品酶制劑的菌株必須是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系較全，不僅可以產(chǎn)生大量果膠酶，而且黑曲霉屬于安全菌株。另外，黑曲霉產(chǎn)生的果膠酶最適 pH值一般在酸性范圍內(nèi)，這也是其被應(yīng)用于食品工業(yè)行業(yè)中的原因之一 研究進(jìn)展 果膠酶 ? 微生物來源蛋白酶制劑常按最適 pH分類 堿性： pH10以上（ 2709枯草菌蛋白酶） 酸性： pH23以下 黑曲霉 中性：多 ? 蛋白酶分類： 內(nèi)肽酶 （蛋白酶） 外肽酶 羧肽酶、氨肽酶 蛋白酶按活性中心可分為絲氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶；按最適 pH值來分又分酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶 葡萄糖 丙酮酸 CO2和 H2O 蛋白、核酸降解自己了解（教材或生物化學(xué)） 生物大分子 微生物小分子代謝的中間體 —丙酮酸 葡萄糖 酵解途徑 丙酮酸 糖異生途徑 乳酸、氨基酸、甘油 糖原 肝糖原分解 糖原合成 核糖 + NADPH+H+ 磷酸戊糖途徑 淀粉 纖維素 消化與吸收 丙酮酸位于無氧分解和有氧分解的交界點(diǎn)上，是糖代謝中具有關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物 從丙酮酸可直接生成丙氨酸，因?yàn)樗梢耘c氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)相結(jié)合，故在氮代謝方面也起著重要的作用 和 CoA反應(yīng)能形成乙酰 CoA，與脂肪酸的代謝也有重要的關(guān)系 因此，丙酮酸在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用 丙酮酸合成路線主要有酒石酸與焦硫酸鉀合成法、乳酸乙酯空氣氧化法、羥基丙酮法、葡萄糖發(fā)酵法等 丙酮酸是一種用途非常廣泛的有機(jī)酸，在化工、制藥和日用化學(xué)品等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途 從代謝的角度看丙酮酸 需要掌握的知識(shí) ? 發(fā)酵 (fermentation),呼吸作用 ,氧化磷酸化 , 底物水平磷酸化 ,新陳代謝 ,同型乳酸發(fā)酵 , ? 異型乳酸發(fā)酵 ,雙歧桿菌發(fā)酵 ? 葡糖分解為丙酮酸的途徑 ? EMP途徑特點(diǎn)、關(guān)鍵酶 ? HMP途徑的重要意義、 關(guān)鍵酶 ? ED途徑的特點(diǎn)、 關(guān)鍵酶 ? 磷酸己糖酮解途徑的特點(diǎn)、 關(guān)鍵酶 ? TCA循環(huán)的重要特點(diǎn) 單糖分解為丙酮酸的四（五）種途徑 ? 分解葡萄糖生成丙酮酸的過程 ? 糖酵解在胞漿中進(jìn)行 ? 葡糖糖需磷酸活化 ? 1分子葡萄糖經(jīng)酵解可凈生成 2分子 ATP ? 是細(xì)胞攝入體內(nèi)的葡萄糖最初經(jīng)歷的酶促分解過程，