【正文】 影響ELISA試驗效果常見問題原因分析及解決辦法ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質(zhì)量。 操作步驟 可能原因 解決辦法 選擇試劑 選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡3060分鐘。 加 樣 ； ，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時)； 。 ：最好將血液先自然存放12小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合510次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測，可放在28℃冰箱中，若要貯存，則置于20℃的低溫冰箱內(nèi)。 。 。 ，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 ，請分批操作。 孵 育 ，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底； ，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。 ； 。 洗 板 ,孔與孔之間液體交叉。 ，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不徹底；洗板針堵塞，抽吸不完全；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。 。 ，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干； ，或多用幾臺洗板機(jī)。 顯 色 1. 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑； 2. 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。 1. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用； 2. 加樣時保持顯色劑不外流； 、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。 終 止 加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。 加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 讀 板 讀板時板底不清潔。 應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。 全過程 。 ，有效提高檢測質(zhì)量。 在實(shí)際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作，同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本，才能保證檢測質(zhì)量?，F(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動酶標(biāo)儀，這對于實(shí)現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。ELISA技術(shù)講座一抗原與抗體的反應(yīng)　抗體　抗體的結(jié)構(gòu)抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤模笑剩╧appa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。IgG的結(jié)構(gòu)見圖。① 木瓜酶裂解部位 ② 胃蛋白酶裂解部位重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab39。）2，能和兩個相同的抗原結(jié)合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。右圖為為甲型肝炎病人血清中IgG抗體和IgM抗體出現(xiàn)的時間和水平?！】乖贵w反應(yīng)　可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→AgAb抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[AgAb]／[Ag][Ab]AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果?！∽钸m比例在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖14。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）?？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實(shí)際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。　特異性抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），隨來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗αhCG和抗βhCG兩種抗體，抗αhCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗βhCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生?！∶舾行栽跍y定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg?！∶庖邷y定在臨床檢驗中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定： 1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。3) 抗生素和藥物。4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗HBs等。5． 標(biāo)記的免疫測定如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物徹底反應(yīng)。以標(biāo)記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。6． 酶免疫測定酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay），簡稱ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗的，雖然含義不完全確切，但已習(xí)用。ELISA技術(shù)講座二原理與分類 ELISA的原理和類型1.　ELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。2.　ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：　雙抗體夾心法測抗原　　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2） 加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（，圖14），如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因為標(biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F（ab39。）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標(biāo)（）。雙抗體夾心法適用于測定