實(shí)驗(yàn)十二dna連接與轉(zhuǎn)化(已修改)
2025-01-29 10:29 本頁(yè)面
【正文】 實(shí)驗(yàn)十二 DNA的連接與轉(zhuǎn)化 2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選 一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘? ? 當(dāng)我們已經(jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)目寺。ɑ虮磉_(dá)，轉(zhuǎn)化）質(zhì)粒載體， 并確定重組方案后，下面要進(jìn)行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 ? 此重組子可轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌中用于對(duì)目的基因的擴(kuò)增以及目的基因表達(dá)（如現(xiàn)代基因工程藥物的生產(chǎn)），還可用于序列分析和轉(zhuǎn)基因等重要生物技術(shù)的研究中。 ＤＮＡ分子的體外連接 ? ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下， 由ＤＮＡ連接酶催化兩個(gè)雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過(guò)程， ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的。 連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題： ? ? 常用的ＤＮＡ連接酶有兩種： (1)來(lái)自大腸桿菌的ＤＮＡ連接酶 (2)來(lái)自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ連接酶。 ? 二者的作用機(jī)理類似。 Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機(jī)制 ? Ｔ４連接酶作用分三步： ? １．Ｔ４ＤＮＡ連接酶與輔助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ復(fù)合物。 ? ２． 酶－ＡＭＰ復(fù)合物結(jié)合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ? ３．產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來(lái) . ? ＤＮＡ連接酶的最適反應(yīng)溫度為３７ ℃ ， ? 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２ ℃ 過(guò)夜。 3. DNA的平未端和粘性末端 ? 由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的 DN
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