堿基順序的化學分析法(已修改)
2025-01-28 20:22 本頁面
【正文】 DNA化學順序方法于 1977年由 ， 因此又稱為 M＆ G法 （ 化學降解法 ） 。 這一方法是將模板 DNA的一端標記 ， 之后按堿基順序逐個地將整個大分子斷裂 ， 標記的DNA片段的長度或大小與每個堿基的所在位置相對應 ， 當這些反應產(chǎn)物經(jīng)過變性聚苯稀酰胺凝膠電泳分離后 ， 其代表的 DNA順序便可以從同位素標記的自顯影帶形上讀出 。 這項技術(shù)可以測出距離標記位點 250核苷酸以內(nèi)的 DNA序列 。 經(jīng)過多年的努力在模板 DNA末端標記和特異性化學反應方面都進行了改進 ， 使這一方法成為 DNA序列分析的基本方法 。 化學降解法測序原理 在 M＆ G法測序系統(tǒng)中，一個末端標記的DNA片段在 4組或 5組互為獨立的化學反應中分別得到部分降解，其中每一組反應特異地針對某一種或某一類堿基。在這幾組反應中通過化學裂解形成的放射性標記的分子具有共同起點 —— 放射性標記末端，而其終點不同 —— 發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中的含有長短不一的 DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在待測 DNA全長片段中的位置。此后，將各組反應產(chǎn)物進行序列膠高壓電壓分離，再通過放射自顯影顯示序列結(jié)果。 原理示意圖 方法成敗的關(guān)鍵 ? 一、對特定堿基進行化學修飾 ? 二、經(jīng)過修飾的堿基從糖環(huán)上脫落， DNA主鏈在修飾堿基 5 ’和 3 ’磷酸二脂鍵斷裂。 DNA樣品的制備 待測 DNA樣品的末端標記 單末端標記 DNA片段的分離純化 堿基特異化學裂解反應 序列膠高壓電泳分解 讀取序列 化學法測序的一般流程 載體的選擇 ? 化學法中用的最多的是 Messing及其同事構(gòu)建的 pUC系列載體。它們是化學法測序中比較好的載體。 ? Puc質(zhì)粒系列圖譜 ? Psp64/圖譜 DNA樣品的制備 DNA樣品必須是來自轉(zhuǎn)化細胞的單菌落，絕對不含有宿主細胞的染色體 DNA及其 RNA。 ? 氯化銫 溴化乙啶梯度平衡離心法純化質(zhì)粒 DNA。 ? 寡核苷酸 ——從固相支持物上洗脫下的寡核苷酸不具有 5’末端磷酸基團。測序前用高壓液相柱或電泳技術(shù)純化進行 5’末端標記。 DNA樣品的末端標記 ? Klenow片段酶介導的標記反應 ： 具有 3 ’凹端的 DNA片段 3種 dNTP混合液 Klenow片段酶緩沖液 ａ 32PdATP Klenow片段酶，混勻后置于 2022 ℃ 保溫 30分鐘。 ℃ 加熱 10
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