【正文】 紅河學(xué)院本科畢業(yè)論文 (設(shè)計(jì))2015年度本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）鹽脅迫對露水草生理和有效成分含量的影響院 － 系：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 專 業(yè)：生物技術(shù) 年 級：2011 學(xué)生姓名： 學(xué) 號： 導(dǎo)師及職稱：（講師） 2015年4月2015 Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate TheEffectonThePhysicsandProportion ofCyanotis arachnoidea bySalt StressDepartment: College of Life Science and TechnologyMajor: BiotechnologyGrade: 2011Student’s Name: Student No.: 201101130277Tutor: Lecturer Tao HongZheng April, 2015摘 要 本研究利用不同濃度的中性鹽溶液處理露水草幼苗，并測定在不同濃度的鹽脅迫下露水草的各項(xiàng)生理指標(biāo)和次生代謝產(chǎn)物含量的變化，從而研究出最適合促進(jìn)露水草次生代謝產(chǎn)物含量增加的鹽濃度。結(jié)果表明：（1）隨著鹽濃度的逐漸遞增，露水草葉片中相對電導(dǎo)率和丙二醛含量逐漸升高；（2）隨著鹽濃度的增加，露水草葉片中光合參數(shù)、光合色素含量逐漸減少；（3）隨著鹽濃度的增加，露水草全株植物中β蛻皮激素含量也隨著增加。結(jié)論：鹽脅迫抑制露水草的生長但促進(jìn)β蛻皮激素產(chǎn)物積累。 關(guān)鍵詞：鹽脅迫；露水草；生理指標(biāo)；β蛻皮激素 ABSTRACTIn this study, by using different concentrations of neutral salt solution treated Cyanotis arachnoidea seedling, and measuring the change of Cyanotis arachnoidea in physiological indicators and secondary metabolite at different concentrations of salt stress, thus study Cyanotis arachnoidea best suited to promote secondary metabolites were increased salt concentration. The results show that: (1) With the gradually increasing salt concentration, Cyanotis arachnoidea leaves relatively relative electric conductivity and MDA content also increased。 (2) With the increase of salt concentration, Cyanotis arachnoidea leaves photosynthetic parameters, photosynthetic pigment content gradually reduced。 (3) with the increase of salt concentration, the whole Cyanotis arachnoidea βecdysone content also increases. Conclusion: salt stress inhibited Cyanotis arachnoidea growth but promote β ecdysone product accumulation.Key words: salt stress。 Cyanotis arachnoidea。 physiological indicators。 βecdysone 目 錄 1 1 1 3，儀器及試劑 3 3 6 6 9 9 10 11 13 13 13 13 13 13 14參考文獻(xiàn) 15致 謝 1715 露水草的研究現(xiàn)狀 露水草(Cyanotis arachnoidea)別名珍珠露水草，屬鴨跖草科藍(lán)耳草屬植物[1]，多年生草本，多生于海拔1100～2700m的亞熱帶山地草叢中、向陽緩坡針闊葉疏林下、草地、山野路邊等處。云南除滇東北與滇西北的高寒山區(qū)外，全省大部分地區(qū)均有分布[2]，在紅河州石屏縣有大面積人工種植[3]，石屏露水草的加工利用是紅河州“十一五”期間重點(diǎn)建設(shè)的項(xiàng)目之一。露水草性溫，味辛、微苦。露水草中次生代謝產(chǎn)物蛻皮激素是一種具有多種藥理作用的甾醇類化學(xué)物質(zhì)，主要作用有：(1）對合成核酸和蛋白質(zhì)具有促進(jìn)作用；（2）可以影響糖代謝，有可能成為一種新型的胰島素增敏劑；（3）對脂類代謝有促進(jìn)作用；（4）有益于尿素平衡，可保護(hù)腎臟功能；（5）對心律不齊有療效；（6）對淋巴系統(tǒng)有效應(yīng)，可調(diào)節(jié)免疫；（7）具抗氧化作用；（8）對腦梗死腦缺血有療效，可改善腦功能障礙；（9）可使內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷；（10）對表皮細(xì)胞分化有促進(jìn)作用等[4] 。蛻皮激素首次發(fā)現(xiàn)是在1954年，Butenandt A和Karlson P從桑蠶蛹中分離鑒定出α蛻皮激素，之后又分離得到生物活性更強(qiáng)的β蛻皮激素。1966年，Nakanishi K等首次從白日青中分離得到植物蛻皮激素，隨后，又有更多的植物分離出了β蛻皮激素，并且發(fā)現(xiàn)在植物中蛻皮激素含量與昆蟲或節(jié)肢動物相比高多許多，尤其是在露水草中，蛻皮激素的含量非常高，是現(xiàn)所知含β蛻皮激素最高的植物之一[56]，%， %[7]，所以露水草具有較高開發(fā)利用價(jià)值。1976年在露水草中提取出高含量次生代謝產(chǎn)物—蛻皮激素，并被認(rèn)為露水草的藥用價(jià)值主要是蛻皮激素的效用[8]。傳統(tǒng)藥用價(jià)值主要體現(xiàn)為祛風(fēng)活絡(luò)，利濕消腫，退虛熱。用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，四肢麻木，腰腿痛，腎炎水腫，虛熱不退。外用于腳癬、濕疹，刀傷等。雖然露水草是一種具有非常高開發(fā)價(jià)值的中藥材，但是通過查閱發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究文獻(xiàn)較少，并且集中于對其化學(xué)成分的分析如何提高其有效成分含量的研究較少。 鹽脅迫的研究現(xiàn)狀 由于農(nóng)業(yè)上化肥使用不當(dāng)，工廠污水隨意排放，氣候干旱，管理不完善等諸多因素，造成全球大部分地區(qū)土地鹽堿化越來越嚴(yán)重。當(dāng)前，108 hm2[9]。中國鹽漬土總面積約 1108 hm2，其中現(xiàn)代鹽漬化土壤約0．37108 hm2， 殘余鹽漬化土壤約 108 hm2，潛在鹽漬化土壤約 108 hm2[10]。中國的鹽漬化土壤主要分布在東北、華北和西北地區(qū)。土壤鹽漬化是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)所面臨的主要問題之一，鹽分脅迫影響著植物產(chǎn)量、蛋白質(zhì)合成和光合作用以及能量代謝[11]。土壤鹽堿化將會影響土壤板結(jié)且肥力下降，另外不利于農(nóng)作物吸收養(yǎng)分，阻礙作物生長。鹽脅迫對植物生長發(fā)育最普遍和最顯著的效應(yīng)就是抑制生長，表現(xiàn)為植株矮小和產(chǎn)量降低[12]。脅迫對植物的生理及次生代謝產(chǎn)物主要有三方面效應(yīng)，有增效效應(yīng)，負(fù)效效應(yīng)，完全抑制效應(yīng)。在一定鹽濃度下鹽脅迫可促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物含量增加，次生代謝產(chǎn)物(Secondary metabolites)是由次生代謝產(chǎn)生的一類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物。次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)的合成和積累是在植物具有相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，一定的環(huán)境條件誘導(dǎo)作用的結(jié)果，生境條件變化將引起植株次生代謝產(chǎn)物含量變化。目前國外對于環(huán)境條件對植株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物形成和積累的誘導(dǎo)作用機(jī)制有很多不同的認(rèn)識，提出了多個(gè)不同假說來解釋不同環(huán)境條件下植物次生代謝的變化。其中碳素/營養(yǎng)平衡假說、生長/分化平衡假說和資源獲得假說[13]都認(rèn)為環(huán)境脅迫條件下，植株生長下降，但次生代謝產(chǎn)物含量增加；而在良好環(huán)境條件下，植株生長快，次生代謝產(chǎn)物含量低。因此，環(huán)境脅迫有利于或促進(jìn)藥用植物次生代謝有效成分的積累。黃璐琦等還提出道地藥材形成“逆境效應(yīng)理論”[14]，作為中藥材“道地性”科學(xué)解釋。鹽脅迫是影響植物生長和產(chǎn)量提高的重要限制因子，因?yàn)辂}脅迫降低了環(huán)境的滲透勢而導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，產(chǎn)生滲透脅迫，從而迫使植物在其自身范圍內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的滲透調(diào)節(jié)。植物對鹽脅迫的反應(yīng)涉及到生理、生化、細(xì)胞等多方面的變化，目的是在高滲透壓的外界環(huán)境中仍然保持水分平衡及正常的光合活性，對鹽脅迫產(chǎn)生耐受。雖然在植物的生長發(fā)育過程中，鹽脅迫會造成植物發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長和分化，使植物的發(fā)育進(jìn)程提前，但是對于藥用植物的有效成分含量增加卻具有一定的促進(jìn)作用。陳光登等[15]發(fā)現(xiàn)，在一定的鹽脅迫下，淫羊藿根、葉和箭葉淫羊藿根、莖、葉均呈現(xiàn)在低濃度范圍內(nèi)總黃酮含量增加。韓立敏等[16]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理促進(jìn)了丹參無菌苗中丹參素含量的影響。但未見鹽脅迫對露水草有效成分含量的相關(guān)研究。 實(shí)驗(yàn)材料，儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)材料材料：露水草種子購于葆元種業(yè)。 實(shí)驗(yàn)儀器 Li6400XT便攜式光合儀、高速離心機(jī)（）、恒溫水浴鍋（常州國華電子有限公，HH4）、紫外分光光度計(jì)(T6新世紀(jì))、可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG9246A型)、恒溫?fù)u床（上海一恒科技有限公司）、電導(dǎo)儀、數(shù)顯超聲波儀、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、研缽、離心管15ml、試管、試管架。 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材N,N二甲基甲酰胺（DMF）、10%三氯乙酸（TCA）溶液、% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液、中性鹽、無水乙醇、β 蛻皮激素、吸水紙、營養(yǎng)袋。 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理露水草種子浸泡12h后播種到大營養(yǎng)袋里，每隔1d澆一次水，當(dāng)露水草幼苗葉長長至7cm時(shí)，進(jìn)行移栽，移栽時(shí)挑選大小一致的幼苗，每個(gè)小花盆內(nèi)移栽5棵，10d后進(jìn)行鹽脅迫處理，鹽脅迫選用中性鹽氯化鈉，濃度設(shè)置為0、50、70、90、120mmolL1，每個(gè)濃度處理5盆，每隔1d澆一次處理液，每盆每次澆100ml，處理10d后測定露水草光合參數(shù)、光合色素、丙二醛、相對電導(dǎo)率和蛻皮激素含量。 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測定 光合參數(shù)的測定實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：選擇晴朗的天氣，測定時(shí)間為上午8:3011:30；實(shí)驗(yàn)前一天將儀器充滿電，檢查儀器的吸收管，調(diào)試好儀器；實(shí)驗(yàn)前一天用濕毛巾擦去苗上的灰塵；實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將要測定的實(shí)驗(yàn)材料提前半小時(shí)放到光下進(jìn)行充分光適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：①儀器安裝；②開機(jī)與校正；③參數(shù)設(shè)置及測定（飽和光強(qiáng)設(shè)為1000molm2s1，飽和二氧化碳設(shè)為500ppm），當(dāng)光合速率穩(wěn)定且胞間二氧化碳大于零時(shí)可以保存此次記錄，測定完一個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)剪下測定部位的葉面積，并坐標(biāo)紙上畫上葉面積；④數(shù)據(jù)存取。 光合色素的測定光合色素提?。?N二甲基甲酰胺進(jìn)行迅速研磨，研磨后至于離心管中，勻漿以4000rmin1離心10min，其上清液即為光合色素提取液。光合色素測定：將光合色素提取液（對照組用N，N二甲基甲酰胺）于波長664nm、647nm、480nm下測定OD值。色素濃度按以下公式計(jì)算(位為mgL1):Chla=12A647