生物化學第10章酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié)(已修改)
2025-01-28 13:26 本頁面
【正文】 第 10章 酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié) 一、酶的活性部位 二、 酶催化反應的獨特性質(zhì) 三、影響酶催化效率的有關(guān)因素 四、酶催化反應機制的實例 五、酶活性的調(diào)節(jié)控制 六、同工酶 (mechanisms of enzyme action and regulation of enzyme activity) 一、酶的活性部位 酶活性部位的特點 Ⅰ 在酶分子中 ， 只有少數(shù)幾個氨基酸殘基直接參與結(jié)合底物和催化反應 ， 這些氨基酸殘基在一級結(jié)構(gòu)上可以相距很遠 ， 但通過肽鏈的折疊 、 盤繞 ， 使它們在空間上相互接近 。 這些殘基在空間上所在的部位稱為活性 部位 （ active site） 或活性中心 （ active center） ， 酶的活性部位往往有一個裂縫或口袋狀的區(qū)域 ， 其形狀與底物相似 。 胰凝乳蛋白酶活性部位的結(jié)構(gòu) 57 102 195 酶活性部位的特點 Ⅱ 當?shù)孜锱c酶通過次級鍵結(jié)合時 ， 底物和酶都可能發(fā)生形變 ， 誘導契合 ， 使得底物與酶的活性部位的形狀恰好吻合 ， 而且負責催化反應的殘基也正好接近將發(fā)生反應的基團或鍵 。 當酶蛋白變性時 ， 構(gòu)象發(fā)生變化 ， 失去上述結(jié)構(gòu)特點 ， 同時也失去了活性 。 雖然酶蛋白中其它殘基不直接參與活性部位的組成 ， 但這些殘基中的大多數(shù)為整個酶蛋白的構(gòu)象作出了不可缺少的貢獻 。 研究酶活性部位的方法 1. 酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾法 （ 1） 非特異性共價修飾 （ 2） 特異性共價修飾 （ 3） 親和標記法 2. 動力學參數(shù)測定法 3. X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法 4. 定點突變法 酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾法 用一種小分子化合物與酶反應 ， 這種化合物與酶的某個或某種殘基側(cè)鏈反應 ， 形成共價結(jié)合 ， 這叫化學修飾 （ chemical modification） 或共價修飾（ covalent modification） ， 這種化合物稱為修飾劑 。酶分子中可以被化學修飾的基團有：巰基 、 羥基 、咪唑基 、 氨基 、 羧基和胍基等 。 當酶活性部位的殘基側(cè)鏈被修飾后 ， 會使酶失去活力 。 將經(jīng)修飾后失去活力的酶水解 ， 鑒定出被修飾的氨基酸 ， 可以得到哪些殘基參與組成活性部位的信息 。 非特異性共價修飾 此 類修飾劑可以修飾活性部位 內(nèi) 或 外 的殘基側(cè)鏈基團 。 若修飾程度與酶活力喪失成正比 ， 則說明被修飾的基團位于活性部位 。 當發(fā)現(xiàn)修飾程度與酶活力喪失成正比時 ， 可在加入底物或競爭性抑制劑的條件下進行修飾 ， 若加入底物或競爭性抑制劑可阻遏修飾劑對酶活力的破壞作用 ， 則進一步證明被修飾的基團位于活性部位 。 特異性共價修飾 此類修飾劑特異性地修飾酶活性部位的殘基 ，同時使酶失活 。 此類修飾劑與酶的活性部位特異性結(jié)合 ， 同時修飾酶活性部位的基團 。 例如二異丙基氟 磷酸 （ DFP） 能特異性地與許多酶的活性部位的 Ser殘基共價結(jié)合 ， 使酶活力喪失 ， 而不修飾非活性部位的 Ser殘基 。 當用 DFP修飾酶后 ， 部分水解酶蛋白 ， 得到含有二異丙基磷?；碾亩?，分析此肽段的氨基酸序列 ， 可得到活性部位 Ser附近 的肽鏈序列 。 DFP修飾酶的 Ser殘基的反應 幾種絲氨酸蛋白酶活性部位的氨基酸序列 酶 氨基酸序列 牛胰蛋白酶 …… SerCysGly Gly AspSerGly Gly ProVal…… 牛胰凝乳蛋白酶 …… SerCysMet Gly AspSerGly Gly ProLeu…… 豬彈性蛋白酶 …… GlyCysGln Gly AspSerGly Gly ProLeu…… 豬凝血酶 …… AspAlaCysGlu Gly AspSerGly Gly Pro…… 親和標記法 能特異性地修飾酶的活性部位的修飾劑很少 ，并且專一性差 ， 經(jīng)常出現(xiàn)也修飾活性部位之外的殘基的情況 。 為了解決此問題 ， 人們合成了一些底物類似物 ， 其上帶有高反應性基團 ， 它們特異地與相應的酶的活性部位結(jié)合 ， 然后與活性部位的殘基反應 ， 這樣就大大提高了修飾的專一性 ，這種方法叫親和標記法 。 TPCK對胰凝乳蛋白酶的親和標記 最典型的例子就是用來修飾胰凝乳蛋白酶的親和標記物對甲苯磺酰 L 苯丙氨酰氯甲基酮（ TPCK） ， 胰凝乳蛋白酶的人工底物是對甲苯磺酰 L苯丙氨酸乙酯 （ TPE） 。 當將 TPDK與胰凝乳蛋白酶一起保溫后 ， 酶失去活性 ， 氨基酸分析表明 ，TPDK修飾了 His57。 TPCK不與胰凝乳蛋白酶原 、變性的胰凝乳蛋白酶 、 DIP胰凝乳蛋白酶反應 。 這些證據(jù)說明 His57是組成酶活性部位的殘基之一 。 TPE和 TPCK的結(jié)構(gòu) 親和標記物 人工底物 動力學參數(shù)測定法 在不同 pH下測定酶活力，可以得到與酶活力直接相關(guān)的可解離基團的 pKa值，從而推測出是些什么殘基。 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法 使底物與酶結(jié)合 ， 制成晶體 ， 再進行 X光晶體衍射分析 ， 可得到底物附近有哪些殘基 。 定點突變法 從基因的水平上對蛋白質(zhì)編碼序列中特定位點的核苷酸進行突變 ， 使得蛋白質(zhì)特定的氨基酸殘基轉(zhuǎn)變成另一種氨基酸殘基 ， 觀察突變對酶活力的影響 。 例如 ， 1987年 Claik將胰蛋白酶 Asp102突變成Asn102， 突變的胰蛋白酶的 kcat只有野生型酶的五千分之一 ， 突變酶水解酯底物的活力僅是野生型酶的萬分之一 ， 可見 Asp102對胰蛋白酶的活力是必需的 。 三、影響酶催化效率的 有關(guān)因素 底物和酶的鄰近效應 與定向效應 （ proximity and orientation） 對于雙底物反應或三底物反應來說 ， 由于酶活性部位對底物有高親和力 ， 增加了參與反應的底物碰撞的幾率 ， 這就是鄰近效應 。 在酶活
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