【正文】 2022/2/12 1 第五章 目的基因的制備 第一節(jié) 目的基因的制備 第二節(jié) 目的基因的分離 2022/2/12 2 一 概 述 ? 基因工程或 DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因。 目的基因 確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能 建立高效表達(dá)系統(tǒng) 構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞） 體外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾 輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體遺傳性狀，包括人體基因治療 2022/2/12 3 二 什么是目的基因 ? 基因工程的主要目的是使優(yōu)良性狀相關(guān)的基因聚集在同一生物體中 ， 創(chuàng)造出具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物種。為此必須從現(xiàn)有生物群體中 ， 根據(jù)需要分離出此類基因 ，即準(zhǔn)備要 分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá) 的基因 通常稱之為 目的基因 。 ? 如抗逆性相關(guān)基因（抗病、抗寒等）、生物藥和保健品相關(guān)基因、毒物降解相關(guān)基因 、工業(yè)用酶等相關(guān)基因等。 2022/2/12 4 ? 一般來(lái)說(shuō)，目的基因的制備戰(zhàn)略分為 兩大類 ? 一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的 基因文庫(kù) ，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫(kù)中挑出含有目的基因的重組克??； ? 另一類是利用 PCR擴(kuò)增 技術(shù)甚至 化學(xué)合成 法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 5 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫(kù)中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫(kù)中釣取目的基因 ? 通過(guò) PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 6 限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法 ? 限制性內(nèi)切酶酶切分離法適于 從簡(jiǎn)單基因組 （如 質(zhì)粒和病毒 ） 中分離目的基因。 ? ① 對(duì)已定序的 DNA分子 ， 只需用已知識(shí)別序列的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行一次或幾次切割 ， 分離純化所需 DNA片段 ， 與適當(dāng)載體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆。 ? ② 對(duì)已知定位的目的基因 ， 只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn) ， 用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割 ， 一次就可獲得目的基因。 2022/2/12 7 所謂 基因就是 具有特定生物學(xué)功能的一段核苷酸序列， 所以只要掌握了其分子結(jié)構(gòu)，完全可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工合成。 1977年，利用化學(xué)途徑首次合成了編碼腦激素的基因（生長(zhǎng)激素釋放因子基因），并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了成功的表達(dá)。從此，化學(xué)合成基因得到了很大的發(fā)展迅速。 早期通過(guò)化學(xué)合成的部分基因 基因 人胰島素 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA ?干擾素 腸促胰液肽 尿抑胃激素 ?干擾素 大小（ bp） 126 542 81 162 453 合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984 基因 視紫紅質(zhì) 前腦菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶 T1 RNA酶Ａ 大?。?bp） 1057 77 170 385 324 375 合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987 化學(xué)法直接合成基因 2022/2/12 8 ： 混合退火 根據(jù)目的基因全序列，分別合成 1215堿基長(zhǎng)的單鏈 DNA小片段 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成有三種戰(zhàn)略： 2022/2/12 9 混合退火 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 補(bǔ)釘延長(zhǎng)法 根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成 1215堿基長(zhǎng)的 單鏈DNA小片段以及 2030堿基長(zhǎng)的 單鏈 DNA中片段 2022/2/12 10 根據(jù)目的基因 的 全序列，分別合成 4050堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段 混合退火 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 大片段酶促法 2022/2/12 11 三種方法各有利弊 化學(xué)合成 DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為 95%則合成 50個(gè)堿基長(zhǎng)的 DNA單鏈大片段的總收率只有 % 2022/2/12 12 化學(xué)合成的單元操作 化學(xué)合成 DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去 ， 每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng) ， 包括：基團(tuán)保護(hù) 、 分離 、 縮合 、 分離 、 去保護(hù) 五大操作單元 。 從反應(yīng)機(jī)理上來(lái)講， DNA化學(xué)合成有 磷酸二酯法 、磷酸三酯法 、 亞磷酸三酯法 ；具體操作過(guò)程又有 液相合成和 固相合成 兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便， DNA合成儀就是根據(jù) 固相亞磷酸三酯法 原理設(shè)計(jì)的 2022/2/12 13 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H 激活 縮合 氧化 脫取代基 ? 玻璃珠 化學(xué)合成的單元操作 ?DMT： 二甲氧基三苯甲基 連接臂 2022/2/12 14 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭 DNA化學(xué)合成的用途 如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 15 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 1 直接法制備基因 ? 2 從基因組文庫(kù)中釣取目的基因 ? 3 從 cDNA文庫(kù)中釣取目的基因 ? 4 利用 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 16 ? 對(duì)于高等真核生物而言，基因組 DNA龐大 ，組成結(jié)構(gòu) 復(fù)雜 ，存在 間隔序列 和 重復(fù)序列 ，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的 比例極其微小 ，大多數(shù)基因難以直接分離得到。 ? 為了解決這個(gè)難題，可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。 ? 但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無(wú)法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增 ,而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的 基因組文庫(kù) 。然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來(lái)。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 17 從基因組文庫(kù)中釣取目的基因 ? ? ? 基因庫(kù) (gene pool):特定生物體全基因組的集合（天然存在） ? 基因文庫(kù) (gene library or gene bank):從特定生物個(gè)體中分離的全部 基因，這些基因以 克隆 的形式存在（人工構(gòu)建） 一個(gè)受體菌的群體之中 , 這個(gè)群體即為這種生物的基因文庫(kù)。 ? 根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為 :基因組文庫(kù)（含有全部基因）； cDNA文庫(kù)（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 18 基因文庫(kù)構(gòu)建的材料來(lái)源 ?材料來(lái)自染色體 DNA或 mRNA 在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的 mRNA一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織 cDNA文庫(kù)或胚胎組織 cDNA文庫(kù)等。很顯然， cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的 cDNA文庫(kù) 2022/2/12 19 基因文庫(kù)的完備性 ? 基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù) N之間的關(guān)系可用下式表示： ? 其中： P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率， ? f=克隆片段的平均大小 /生物基因組的大小 ? N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 例如，人的單倍體 DNA總長(zhǎng)為 x 109 bp，基因文庫(kù)中克隆片段的平均大小為 15 kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為 45萬(wàn)個(gè)克?。欢?dāng)完備性提高到 ，基因文庫(kù)至少需要 180萬(wàn)個(gè)克隆 2022/2/12 20 For example : 期望值為 ，插入片斷為 20kb的 ( 106 bp) 和 human (3 109 bp) 基因組的克隆數(shù)的計(jì)算 N = = 103 ln( ) ln[1(2 104/ 106)] Nhuman= = 105 ln() ln[1(2 104/3 109)] 這個(gè)例子說(shuō)明用質(zhì)粒載體（插入片段 510kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫(kù)，只需要幾千個(gè)克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 21 ? 除了盡可能高的 完備性外， 一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件： ? 重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大 以減輕篩選工作的壓力 ? 載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度 避免基因被分隔克隆 ? 克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域 以利克隆排序 ? 克隆片段易于從載體分子上完整卸下 ? 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選 2022/2/12 22 ? ① 材料的選擇及基因組 DNA的制備； ? ②載體的選擇； ? ③載體與基因組 DNA的限制性酶切； ? ④ 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞； ? ⑤ 重組克隆的篩選和保存。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 23 基因組 DNA的制備 ? A ? A ? A ? A ?文庫(kù)構(gòu)建的 DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過(guò)度的斷裂。 ?制備的 DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高 ?用常規(guī)方法制備的染色體 DNA的長(zhǎng)度一般在 100 kb左右。如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有 SDS、蛋白酶 K、 RNase的緩沖液中浸泡，可獲得 1000 kb大小的 DNA片段 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 24 載體的選擇 ? 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組 文庫(kù)構(gòu)建的 載體通常選 裝載量較大的 lDNA或 考斯質(zhì)粒 ；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和 人類）需使用 YAC或 BAC載體。 由于絕大多數(shù)真核生物的 mRNA小于 10 kb，因此用于 cDNA文庫(kù)構(gòu) 建的載體 通常選質(zhì)粒 。 上述幾種載體的最大裝載量如下： ? lDNA ? 質(zhì)粒 ? 考斯質(zhì)粒 ?