【正文】 第二部分 色譜分析 1 第二部分 色譜分析 第一章薄層色譜法（ TLC） 一 薄層色譜法概述 薄層色譜法是一種基于混合物組分在固定相和流動相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法。與HPLC 不同， TLC 將固定相涂鋪在栽板上，使之形成均勻的薄層。被分離的樣品溶液點加在薄層板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流動相（深度約 5mm）的密閉缸中，進行色譜展開，實現混合組分分離。被展開的組分斑點即色譜譜帶，通過適當技術對色譜譜帶進行處理可得到定性和定量的檢測結果。 薄層色譜法具有技術比較簡單，操作容易，分析速度快，高分辨能力，結果直觀，不需 昂貴儀器設備就可以分離較復雜混合物等特點。 二 薄層色譜法中的薄層板、薄層板的涂鋪、點樣和展開 （一）薄層板 TLC 分離的選擇性主要取決于固定相的化學組成及其表面的化學性質。可通過改變涂層材料的化學組成或對材料表面進行化學改性來實現改變薄層色譜分離的選擇性。此外，固定相的物理性質，如比表面積、比空容、平均孔徑等也對其色譜行為產生影響。 （ 1）載體 對 TLC 載體 的基本要求為：機械強度好、化學惰性好（對溶劑、顯色劑等）、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻、價格適宜。 （ 2）固定相 TLC 固定相包括改性固定 相和未改性固定相兩類。硅膠和氧化鋁是最常用的兩種未改性固定相。 （ 3）粘合劑 在制備薄層板時，一般需在吸附劑中加入適量粘合劑，其目的是使吸附劑顆粒之間相互粘附并使吸附劑薄層緊密的附著在載板上。常用的粘合劑可分為無機粘合劑和有機粘合劑兩類。 （ 4）熒光指示劑 熒光指示劑是便于在薄層色譜圖上對一些基本化合物斑點（無顏色斑點、無特征紫外吸收斑點）定位的試劑。加入熒光指示劑后，可以使這些化合物斑點在激發(fā)光波照射下顯出清晰的熒光，便于檢測。 （二）薄層板的涂鋪 涂板方法可以分為涂布法、傾注法、噴灑法及浸漬法四 類，其中涂布法是應用最廣泛的涂板方法。 TLC 固定相薄層涂鋪大多采用濕法勻漿，要求薄層均勻、平整、無氣泡、不易造成凹坑和龜裂。 薄層板活化處理可以獲得適宜活性，提高色譜分離效率和選擇性。 （三）點樣 點樣是 TLC 分離和精確定量的關鍵。不同種類的 樣品 常需選用不同的配樣溶 劑，一般采用易揮發(fā)的非極性或弱極性溶劑配樣。離子型化合物樣品， 常需先衍生化成在揮發(fā)性強、極性小的溶劑中易溶解的樣品衍生物。最適合點樣的樣品濃度應為（ 1～ 5） μ g μ L1，點樣體積視點樣技術不同而異。 TLC 定量分析時，樣品量的適宜范圍為最小檢出 量的幾倍至幾十倍。樣品原點一般在 1mm 左右為佳，原點過大或樣品量過大，會導致分離變壞。點樣步驟一般占 TLC 全部分析時間的三分之一左右，所以使點樣儀器化、自動化，既快又準，獲得好的重復性，是 TLC 工作者所期盼的。 （四）展開 TLC 展開就是流動相沿薄層（固定相）運動，以實現樣品混合組分分離的過程。這一過程需在具有一定形狀的展開室中進行。薄層展開 有 三種形式，直線式展開方式為實際應用中使用最普遍的展開方式。 三 薄層色譜流動相與展開機制 （一）對流動相溶劑選擇的基本考慮 薄層色譜溶劑的選擇對分離的影響很大。與 HPLC同理，對復雜樣品的分離能否得到理想的結果，流動相的選擇是最重要的因素 之一 ，不同溶質與流動相分子、第二部分 色譜分析 2 固定相分子間的作用力不同，因此其移動速度也不同，最終 導致 樣品中各組分的分離。對流動相的選擇不僅需考慮極性、選擇性等因素，更基本的應注意以下因素的影響： (1)溶劑純度，含有雜質影響分離。 (2)溶劑吸收環(huán)境水分，會使極性等性質改變。 (3)存放條件不適宜或貯存時間過長，溶劑會變性。 (4)混合流動相之間發(fā)生作用會使溶劑性質改變。溶劑極易揮發(fā)，流動相組成隨時改變。 （二）幾種常用薄層色譜分離模式的展開機制 在 TLC分離中，液固展開是一種最經典的展開方式。液固展開常用極性吸附硅膠、氧化鋁作固定相。流動相依其極性可在吸附劑表面形成單分子或雙分子溶劑吸附層，展開過程中，組分的保留及分離選擇性主要有以下三種因素決定： a. 溶劑對樣品的溶解能力； b. 溶質和流動相分子對固定相表面活性吸附位點的競爭； c. 溶質分子與吸附劑表面上吸附中心間的特殊作用力。 與液液分配柱色譜分配機理相同，組分在互不相溶的兩液相中的溶解度不同，因此遷移速率存在差異，在遷移過程中得到分離。 除以上兩種展開機制外，還有化學鍵合 相展開和離子交換展開。 四 薄層色譜吸附劑與載體的選擇 ： ； ，因而能較好的分離不同的化學組分； 不 溶解； 、溶劑和展開劑起化學反應或破壞、分解作用 、在使用過程中不會碎裂 ，既能吸附樣品組分，又易于解吸； ，最好是白色固體。 ： ； ，與展開劑和樣品組 成不起化學反應或分解作用； ； 。 五 薄層色譜掃描儀 （一）儀器結構 TLC 掃描儀結構主要包括光學元件組合系統(tǒng)、電子元件組合系統(tǒng)及機械元件組合系統(tǒng)。 （ 二 ） 主要功能 薄層色譜掃描儀主要用于 TLC 圖被分離斑點和薄層空白的光學相應信號測 量。要求儀器光源穩(wěn)定，光波單色性能好，光波長在（ 200～ 800nm）檢測器靈敏度高。 六 薄層色譜定性定量方法 （一）斑點定位 斑點定位必須采用非破壞性方法。當斑點紫外光顯示時，可采用長波長和短波長紫外燈，使用 方便、靈活。采用化學試劑顯色時，通過手動或電動噴霧器向展開好的薄層板噴灑顯色試劑。 （ 二 ） 定性方法 在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物的 Rf 值一定，比較未知物和標準物的 Rf 值，能夠作為鑒定未知物的依據。Rf 值的準確測定受多方面因素影響，為了增加 Rf 值定性的可靠性，必須通過改變色譜系統(tǒng)的選擇性，重復測定第二部分 色譜分析 3 同一化合物的 Rf 值。如果在分離機理不同的色譜體系中，比較 Rf 值仍能得到肯定的結果，那么其可靠性將更大。 板上化學反應定性主要有以下兩種方式： a. 反應后生成特征顏色的化合物，借以鑒 定反應物； b. 反應后生成復雜的、無法鑒定組分的混和物，但可根據生成物的“指紋” 特征加以鑒定； c. 除以上兩種定性反方法外，還有板上光譜定性、 TLC 與其他聯用技術間 接聯用定性、薄層色譜－傅里葉變換紅外光譜聯用定性以及薄層色譜－質譜聯用定性。 （ 三 ） 定量方法 間接定量法就是將 TLC 已分離的物質斑點洗脫下來，再采用其他方法對該洗脫液進行定量分析。 TLC 間接定量的關鍵是斑點組分的定量洗脫。選用怎樣的洗脫方法，取決于，組分和薄層吸附劑的性質。用來洗脫組分斑點的溶劑，對下一步定量方法應無影響。 a. 分光光度 法 將下來的洗脫液配制成標準體積，再同樣條件下對樣品和 標準液進行吸光值測量。 b. HPLC 法 以 TLC 法斑點洗脫液直接作 HPLC分離和定量 c. GC 法 以 TLC 法斑點洗脫液直接作 GC 分離和定量。 d. 質譜法 采用組分質譜圖中的特征離子峰可進行定量。 a. 斑點面積測量法 以半透明紙掃下 TLC 圖上的斑點界限，然后測量其面 積。將斑點面積同平行操作的標準樣面積相比較進行定量。 b. 目測法 將被測樣品和系列溶液點在同一薄層板上，展開后用適當方法 顯色，可以得到系列斑點，將被測樣品的斑點面積大小和顏色與標準系 列的斑點相比較，可推測出樣品的含量范圍。這種定量法非常適用于對常規(guī)大量樣品的重復分析。 七 應用實例 — TLC測定黃曲霉毒素 B1 （一）、原理 根據黃曲霉毒素 B1 能在波長 365 毫微米紫外光下產生藍紫色熒光的特性，采取薄層層析法，將樣品經提取、濃縮、薄層分離后，利用其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定其含量。 （二）、試劑 ：沸程 30－ 60℃ ：如不是無水乙醚，則應脫水后再用。 G：薄層層析用 ：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混勻冰箱存放備用。 ： 5％次氯酸鈉溶液，取 100克漂粉精，加入 500 毫升水，攪勻，另溶解 70 克碳酸鈉（ Na2Co H2O）于 500 毫升溫水中，溶后，倒入上述溶液中攪勻、澄清、過濾、備用。 ①標準儲備液（ 微克 /毫升）： GBW(E)090015嚴格控制、應加鎖于冰箱中避光存放。（每次記錄用量、余量，以備復查）。 第二部分 色譜分析 4 ②稀釋液Ⅰ（ 微克 /毫升）取儲備液加苯乙腈混合液稀釋。 ③稀釋液Ⅱ（ 微克 /毫升）取稀釋液 1 毫升以苯乙腈混合液稀釋。 （三）、儀器 （可以自制） ： 5 20 厘米 ：（層析）內長 25 厘米，寬 6 厘米，高 4厘米 － 10 毫升刻度吸管 ： 365nm， 220v， 125w，啟動電流 ： 20 微升， 10 微升 ： 125 毫升 ： 60 毫升 ：具塞 2 毫升 ：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小時揮干備用 （四）、操作方法 ①適用于大米、玉米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等。稱取經過粉碎（ 20 目篩）的樣品 20克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 30 毫升，甲醇水（ 55∶ 45） 100 毫升，加塞后加水少許，蓋嚴防漏，振蕩 30 分鐘，靜置片刻，以脫脂棉過濾于分液漏斗中，待分層，放出下層的甲醇水溶液 20 毫升（相當于樣品 4克）于另一分漏斗中，加氯仿 20 毫升，振搖二分鐘，靜止分層。另備一漏斗底部鋪脫脂棉少許，再加無水硫酸鈉 10 克，下接 60 毫升蒸發(fā)皿，漏斗中的無水硫酸鈉先用氯仿濕潤。將分層后 的氯仿放入已備好的具有無水硫酸鈉的漏斗中，過濾，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分層后一并濾于同一蒸發(fā)皿中，最后用少量氯仿洗滌濾器，洗液并入以上蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放入通風櫥內于65℃水浴上通風揮干，然后放在水浴上冷卻 2－ 3 分鐘，準確加入苯乙腈 1 毫升。用帶橡皮頭的滴管的尖端將殘渣充分混合，若有結晶析出（苯），將蒸發(fā)皿從水浴上取下，繼續(xù)溶解，混合，晶體消失，再用此管吸取上清液，轉移于 2 毫升樣液瓶中，若溶液不夠澄清，應離心，或放置等候澄清，取上清液供薄層點板用。 ［注］加入氯仿振搖 2 分鐘如出現乳化現象，可滴加甲醇促使 分層或用電吹風機吹熱風促使分層。 含油脂較多的樣品如花生等也可采用脫油提取，即稱取粉碎樣品 20 克移于濾紙筒內，筒內塞以少量脫脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器內，在 75－ 85℃水浴上以石油醚提取脫油 8 小時，然后將濾紙筒揮干。將脫油后的樣品移于 250 毫升具塞三角燒瓶內，進行檢驗。 如樣品是玉米、大米、小麥時亦可采用下法提?。悍Q取粉碎過篩樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶內，用滴管滴加 6 毫升水，使樣品濕潤，并準確加入氯仿 60毫升，振蕩 30 分，加無水硫酸鈉 12 克，振搖靜止 30分；以脫脂棉過濾取濾液 12 毫升（相當于樣品 4 克）于蒸發(fā)皿，以下步驟與①同。 ②適用于花生油、香油、芽籽油等。 稱取樣品 4 克于小燒杯中，用正已烷 20 毫升轉移于 125 毫升分液漏斗中，再用甲醇水（ 55+45） 20 毫升分數次洗滌小燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖 2分鐘，靜止分層后，將下層甲醇水溶液移于第二個分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水 5 毫升，振蕩提取一次，甲醇水溶液一并移入第二個分液漏斗中，在第二個分液漏斗中加入氯仿 20 毫升，振搖二分靜止分層以后按①操作。 ③適用于醬油、醋，方法有二： 第一法：稱取樣品 10 克于小燒杯中，為防止提取時乳化，加氯化鈉 4 克，移于分液漏斗中，燒杯用氯仿15 毫升分次洗滌，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振搖 2 分鐘，靜止分層后按第①操作。最后加入 毫升苯乙腈溶解，此液每毫升相當于樣品 4 克。 第二法：稱取樣品 10 克移于分液漏斗中，加甲醇12 毫升（以醬油代替水，故甲醇與水體積比仍約為55+45）加氯仿 20 毫升提取，以下自振搖 2 分鐘起，按①操作，最后加苯乙腈 毫升，每毫升相當于樣品 4第二部分 色譜分析 5 克。 ④適用于醬類（包括豆乳制品） 稱取樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 20 毫升與甲醇水 50 毫升，振蕩 30 分鐘，靜止片刻，以脫脂棉過濾 ，濾液靜止分層后，取甲醇水 24 毫升于分液漏斗中加入氯仿 20 毫升振蕩 2 分靜止分層下以按①操作，最后加入苯乙腈 2 毫升，每毫升相當于樣品 4 克。 注：以上檢品極易乳化，實在分不開層時，可采用離心分層的辦法。 ⑤適用于發(fā)酵酒類 稱取樣品 10 克于小燒杯中，以氯仿 15 毫升分次洗于分液漏斗中，振搖 2 分鐘，靜