【正文】 第二部分 色譜分析 1 第二部分 色譜分析 第一章薄層色譜法（ TLC） 一 薄層色譜法概述 薄層色譜法是一種基于混合物組分在固定相和流動(dòng)相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法。與HPLC 不同， TLC 將固定相涂鋪在栽板上，使之形成均勻的薄層。被分離的樣品溶液點(diǎn)加在薄層板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流動(dòng)相（深度約 5mm）的密閉缸中，進(jìn)行色譜展開(kāi)，實(shí)現(xiàn)混合組分分離。被展開(kāi)的組分斑點(diǎn)即色譜譜帶，通過(guò)適當(dāng)技術(shù)對(duì)色譜譜帶進(jìn)行處理可得到定性和定量的檢測(cè)結(jié)果。 薄層色譜法具有技術(shù)比較簡(jiǎn)單，操作容易，分析速度快，高分辨能力，結(jié)果直觀，不需 昂貴儀器設(shè)備就可以分離較復(fù)雜混合物等特點(diǎn)。 二 薄層色譜法中的薄層板、薄層板的涂鋪、點(diǎn)樣和展開(kāi) （一）薄層板 TLC 分離的選擇性主要取決于固定相的化學(xué)組成及其表面的化學(xué)性質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)改變涂層材料的化學(xué)組成或?qū)Σ牧媳砻孢M(jìn)行化學(xué)改性來(lái)實(shí)現(xiàn)改變薄層色譜分離的選擇性。此外，固定相的物理性質(zhì)，如比表面積、比空容、平均孔徑等也對(duì)其色譜行為產(chǎn)生影響。 （ 1）載體 對(duì) TLC 載體 的基本要求為：機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)惰性好（對(duì)溶劑、顯色劑等）、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻、價(jià)格適宜。 （ 2）固定相 TLC 固定相包括改性固定 相和未改性固定相兩類。硅膠和氧化鋁是最常用的兩種未改性固定相。 （ 3）粘合劑 在制備薄層板時(shí)，一般需在吸附劑中加入適量粘合劑，其目的是使吸附劑顆粒之間相互粘附并使吸附劑薄層緊密的附著在載板上。常用的粘合劑可分為無(wú)機(jī)粘合劑和有機(jī)粘合劑兩類。 （ 4）熒光指示劑 熒光指示劑是便于在薄層色譜圖上對(duì)一些基本化合物斑點(diǎn)（無(wú)顏色斑點(diǎn)、無(wú)特征紫外吸收斑點(diǎn)）定位的試劑。加入熒光指示劑后，可以使這些化合物斑點(diǎn)在激發(fā)光波照射下顯出清晰的熒光，便于檢測(cè)。 （二）薄層板的涂鋪 涂板方法可以分為涂布法、傾注法、噴灑法及浸漬法四 類，其中涂布法是應(yīng)用最廣泛的涂板方法。 TLC 固定相薄層涂鋪大多采用濕法勻漿，要求薄層均勻、平整、無(wú)氣泡、不易造成凹坑和龜裂。 薄層板活化處理可以獲得適宜活性，提高色譜分離效率和選擇性。 （三）點(diǎn)樣 點(diǎn)樣是 TLC 分離和精確定量的關(guān)鍵。不同種類的 樣品 常需選用不同的配樣溶 劑，一般采用易揮發(fā)的非極性或弱極性溶劑配樣。離子型化合物樣品， 常需先衍生化成在揮發(fā)性強(qiáng)、極性小的溶劑中易溶解的樣品衍生物。最適合點(diǎn)樣的樣品濃度應(yīng)為（ 1～ 5） μ g μ L1，點(diǎn)樣體積視點(diǎn)樣技術(shù)不同而異。 TLC 定量分析時(shí)，樣品量的適宜范圍為最小檢出 量的幾倍至幾十倍。樣品原點(diǎn)一般在 1mm 左右為佳，原點(diǎn)過(guò)大或樣品量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致分離變壞。點(diǎn)樣步驟一般占 TLC 全部分析時(shí)間的三分之一左右，所以使點(diǎn)樣儀器化、自動(dòng)化，既快又準(zhǔn)，獲得好的重復(fù)性，是 TLC 工作者所期盼的。 （四）展開(kāi) TLC 展開(kāi)就是流動(dòng)相沿薄層（固定相）運(yùn)動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)樣品混合組分分離的過(guò)程。這一過(guò)程需在具有一定形狀的展開(kāi)室中進(jìn)行。薄層展開(kāi) 有 三種形式，直線式展開(kāi)方式為實(shí)際應(yīng)用中使用最普遍的展開(kāi)方式。 三 薄層色譜流動(dòng)相與展開(kāi)機(jī)制 （一）對(duì)流動(dòng)相溶劑選擇的基本考慮 薄層色譜溶劑的選擇對(duì)分離的影響很大。與 HPLC同理，對(duì)復(fù)雜樣品的分離能否得到理想的結(jié)果，流動(dòng)相的選擇是最重要的因素 之一 ，不同溶質(zhì)與流動(dòng)相分子、第二部分 色譜分析 2 固定相分子間的作用力不同，因此其移動(dòng)速度也不同，最終 導(dǎo)致 樣品中各組分的分離。對(duì)流動(dòng)相的選擇不僅需考慮極性、選擇性等因素，更基本的應(yīng)注意以下因素的影響： (1)溶劑純度，含有雜質(zhì)影響分離。 (2)溶劑吸收環(huán)境水分，會(huì)使極性等性質(zhì)改變。 (3)存放條件不適宜或貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶劑會(huì)變性。 (4)混合流動(dòng)相之間發(fā)生作用會(huì)使溶劑性質(zhì)改變。溶劑極易揮發(fā)，流動(dòng)相組成隨時(shí)改變。 （二）幾種常用薄層色譜分離模式的展開(kāi)機(jī)制 在 TLC分離中，液固展開(kāi)是一種最經(jīng)典的展開(kāi)方式。液固展開(kāi)常用極性吸附硅膠、氧化鋁作固定相。流動(dòng)相依其極性可在吸附劑表面形成單分子或雙分子溶劑吸附層，展開(kāi)過(guò)程中，組分的保留及分離選擇性主要有以下三種因素決定： a. 溶劑對(duì)樣品的溶解能力； b. 溶質(zhì)和流動(dòng)相分子對(duì)固定相表面活性吸附位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)； c. 溶質(zhì)分子與吸附劑表面上吸附中心間的特殊作用力。 與液液分配柱色譜分配機(jī)理相同，組分在互不相溶的兩液相中的溶解度不同，因此遷移速率存在差異，在遷移過(guò)程中得到分離。 除以上兩種展開(kāi)機(jī)制外，還有化學(xué)鍵合 相展開(kāi)和離子交換展開(kāi)。 四 薄層色譜吸附劑與載體的選擇 ： ； ，因而能較好的分離不同的化學(xué)組分； 不 溶解； 、溶劑和展開(kāi)劑起化學(xué)反應(yīng)或破壞、分解作用 、在使用過(guò)程中不會(huì)碎裂 ，既能吸附樣品組分，又易于解吸； ，最好是白色固體。 ： ； ，與展開(kāi)劑和樣品組 成不起化學(xué)反應(yīng)或分解作用； ； 。 五 薄層色譜掃描儀 （一）儀器結(jié)構(gòu) TLC 掃描儀結(jié)構(gòu)主要包括光學(xué)元件組合系統(tǒng)、電子元件組合系統(tǒng)及機(jī)械元件組合系統(tǒng)。 （ 二 ） 主要功能 薄層色譜掃描儀主要用于 TLC 圖被分離斑點(diǎn)和薄層空白的光學(xué)相應(yīng)信號(hào)測(cè) 量。要求儀器光源穩(wěn)定，光波單色性能好，光波長(zhǎng)在（ 200～ 800nm）檢測(cè)器靈敏度高。 六 薄層色譜定性定量方法 （一）斑點(diǎn)定位 斑點(diǎn)定位必須采用非破壞性方法。當(dāng)斑點(diǎn)紫外光顯示時(shí)，可采用長(zhǎng)波長(zhǎng)和短波長(zhǎng)紫外燈，使用 方便、靈活。采用化學(xué)試劑顯色時(shí)，通過(guò)手動(dòng)或電動(dòng)噴霧器向展開(kāi)好的薄層板噴灑顯色試劑。 （ 二 ） 定性方法 在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物的 Rf 值一定，比較未知物和標(biāo)準(zhǔn)物的 Rf 值，能夠作為鑒定未知物的依據(jù)。Rf 值的準(zhǔn)確測(cè)定受多方面因素影響，為了增加 Rf 值定性的可靠性，必須通過(guò)改變色譜系統(tǒng)的選擇性，重復(fù)測(cè)定第二部分 色譜分析 3 同一化合物的 Rf 值。如果在分離機(jī)理不同的色譜體系中，比較 Rf 值仍能得到肯定的結(jié)果，那么其可靠性將更大。 板上化學(xué)反應(yīng)定性主要有以下兩種方式： a. 反應(yīng)后生成特征顏色的化合物，借以鑒 定反應(yīng)物； b. 反應(yīng)后生成復(fù)雜的、無(wú)法鑒定組分的混和物，但可根據(jù)生成物的“指紋” 特征加以鑒定； c. 除以上兩種定性反方法外，還有板上光譜定性、 TLC 與其他聯(lián)用技術(shù)間 接聯(lián)用定性、薄層色譜－傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用定性以及薄層色譜－質(zhì)譜聯(lián)用定性。 （ 三 ） 定量方法 間接定量法就是將 TLC 已分離的物質(zhì)斑點(diǎn)洗脫下來(lái)，再采用其他方法對(duì)該洗脫液進(jìn)行定量分析。 TLC 間接定量的關(guān)鍵是斑點(diǎn)組分的定量洗脫。選用怎樣的洗脫方法，取決于，組分和薄層吸附劑的性質(zhì)。用來(lái)洗脫組分斑點(diǎn)的溶劑，對(duì)下一步定量方法應(yīng)無(wú)影響。 a. 分光光度 法 將下來(lái)的洗脫液配制成標(biāo)準(zhǔn)體積，再同樣條件下對(duì)樣品和 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行吸光值測(cè)量。 b. HPLC 法 以 TLC 法斑點(diǎn)洗脫液直接作 HPLC分離和定量 c. GC 法 以 TLC 法斑點(diǎn)洗脫液直接作 GC 分離和定量。 d. 質(zhì)譜法 采用組分質(zhì)譜圖中的特征離子峰可進(jìn)行定量。 a. 斑點(diǎn)面積測(cè)量法 以半透明紙掃下 TLC 圖上的斑點(diǎn)界限，然后測(cè)量其面 積。將斑點(diǎn)面積同平行操作的標(biāo)準(zhǔn)樣面積相比較進(jìn)行定量。 b. 目測(cè)法 將被測(cè)樣品和系列溶液點(diǎn)在同一薄層板上，展開(kāi)后用適當(dāng)方法 顯色，可以得到系列斑點(diǎn)，將被測(cè)樣品的斑點(diǎn)面積大小和顏色與標(biāo)準(zhǔn)系 列的斑點(diǎn)相比較，可推測(cè)出樣品的含量范圍。這種定量法非常適用于對(duì)常規(guī)大量樣品的重復(fù)分析。 七 應(yīng)用實(shí)例 — TLC測(cè)定黃曲霉毒素 B1 （一）、原理 根據(jù)黃曲霉毒素 B1 能在波長(zhǎng) 365 毫微米紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光的特性，采取薄層層析法，將樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，利用其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定其含量。 （二）、試劑 ：沸程 30－ 60℃ ：如不是無(wú)水乙醚，則應(yīng)脫水后再用。 G：薄層層析用 ：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混勻冰箱存放備用。 ： 5％次氯酸鈉溶液，取 100克漂粉精，加入 500 毫升水，攪勻，另溶解 70 克碳酸鈉（ Na2Co H2O）于 500 毫升溫水中，溶后，倒入上述溶液中攪勻、澄清、過(guò)濾、備用。 ①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（ 微克 /毫升）： GBW(E)090015嚴(yán)格控制、應(yīng)加鎖于冰箱中避光存放。（每次記錄用量、余量，以備復(fù)查）。 第二部分 色譜分析 4 ②稀釋液Ⅰ（ 微克 /毫升）取儲(chǔ)備液加苯乙腈混合液稀釋。 ③稀釋液Ⅱ（ 微克 /毫升）取稀釋液 1 毫升以苯乙腈混合液稀釋。 （三）、儀器 （可以自制） ： 5 20 厘米 ：（層析）內(nèi)長(zhǎng) 25 厘米，寬 6 厘米，高 4厘米 － 10 毫升刻度吸管 ： 365nm， 220v， 125w，啟動(dòng)電流 ： 20 微升， 10 微升 ： 125 毫升 ： 60 毫升 ：具塞 2 毫升 ：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小時(shí)揮干備用 （四）、操作方法 ①適用于大米、玉米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等。稱取經(jīng)過(guò)粉碎（ 20 目篩）的樣品 20克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 30 毫升，甲醇水（ 55∶ 45） 100 毫升，加塞后加水少許，蓋嚴(yán)防漏，振蕩 30 分鐘，靜置片刻，以脫脂棉過(guò)濾于分液漏斗中，待分層，放出下層的甲醇水溶液 20 毫升（相當(dāng)于樣品 4克）于另一分漏斗中，加氯仿 20 毫升，振搖二分鐘，靜止分層。另備一漏斗底部鋪脫脂棉少許，再加無(wú)水硫酸鈉 10 克，下接 60 毫升蒸發(fā)皿，漏斗中的無(wú)水硫酸鈉先用氯仿濕潤(rùn)。將分層后 的氯仿放入已備好的具有無(wú)水硫酸鈉的漏斗中，過(guò)濾，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分層后一并濾于同一蒸發(fā)皿中，最后用少量氯仿洗滌濾器，洗液并入以上蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥內(nèi)于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在水浴上冷卻 2－ 3 分鐘，準(zhǔn)確加入苯乙腈 1 毫升。用帶橡皮頭的滴管的尖端將殘?jiān)浞只旌?，若有結(jié)晶析出（苯），將蒸發(fā)皿從水浴上取下，繼續(xù)溶解，混合，晶體消失，再用此管吸取上清液，轉(zhuǎn)移于 2 毫升樣液瓶中，若溶液不夠澄清，應(yīng)離心，或放置等候澄清，取上清液供薄層點(diǎn)板用。 ［注］加入氯仿振搖 2 分鐘如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使 分層或用電吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)促使分層。 含油脂較多的樣品如花生等也可采用脫油提取，即稱取粉碎樣品 20 克移于濾紙筒內(nèi)，筒內(nèi)塞以少量脫脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器內(nèi)，在 75－ 85℃水浴上以石油醚提取脫油 8 小時(shí)，然后將濾紙筒揮干。將脫油后的樣品移于 250 毫升具塞三角燒瓶?jī)?nèi)，進(jìn)行檢驗(yàn)。 如樣品是玉米、大米、小麥時(shí)亦可采用下法提?。悍Q取粉碎過(guò)篩樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶?jī)?nèi)，用滴管滴加 6 毫升水，使樣品濕潤(rùn)，并準(zhǔn)確加入氯仿 60毫升，振蕩 30 分，加無(wú)水硫酸鈉 12 克，振搖靜止 30分；以脫脂棉過(guò)濾取濾液 12 毫升（相當(dāng)于樣品 4 克）于蒸發(fā)皿，以下步驟與①同。 ②適用于花生油、香油、芽籽油等。 稱取樣品 4 克于小燒杯中，用正已烷 20 毫升轉(zhuǎn)移于 125 毫升分液漏斗中，再用甲醇水（ 55+45） 20 毫升分?jǐn)?shù)次洗滌小燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖 2分鐘，靜止分層后，將下層甲醇水溶液移于第二個(gè)分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水 5 毫升，振蕩提取一次，甲醇水溶液一并移入第二個(gè)分液漏斗中，在第二個(gè)分液漏斗中加入氯仿 20 毫升，振搖二分靜止分層以后按①操作。 ③適用于醬油、醋，方法有二： 第一法：稱取樣品 10 克于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加氯化鈉 4 克，移于分液漏斗中，燒杯用氯仿15 毫升分次洗滌，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振搖 2 分鐘，靜止分層后按第①操作。最后加入 毫升苯乙腈溶解，此液每毫升相當(dāng)于樣品 4 克。 第二法：稱取樣品 10 克移于分液漏斗中，加甲醇12 毫升（以醬油代替水，故甲醇與水體積比仍約為55+45）加氯仿 20 毫升提取，以下自振搖 2 分鐘起，按①操作，最后加苯乙腈 毫升，每毫升相當(dāng)于樣品 4第二部分 色譜分析 5 克。 ④適用于醬類（包括豆乳制品） 稱取樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 20 毫升與甲醇水 50 毫升，振蕩 30 分鐘，靜止片刻，以脫脂棉過(guò)濾 ，濾液靜止分層后，取甲醇水 24 毫升于分液漏斗中加入氯仿 20 毫升振蕩 2 分靜止分層下以按①操作，最后加入苯乙腈 2 毫升，每毫升相當(dāng)于樣品 4 克。 注：以上檢品極易乳化，實(shí)在分不開(kāi)層時(shí)，可采用離心分層的辦法。 ⑤適用于發(fā)酵酒類 稱取樣品 10 克于小燒杯中，以氯仿 15 毫升分次洗于分液漏斗中，振搖 2 分鐘，靜