生物技術(shù)課件——02基因工程常用工具酶(已修改)
2025-01-20 02:09 本頁(yè)面
【正文】 ? 基因工程的重要特點(diǎn)之一是在體外實(shí)行 DNA分子的切割和重新連接。因此，工具酶是 DNA體外操作必不可少的工具。 ? 取得編碼某種藥物的目的基因，大多需要工具酶－限制性核酸內(nèi)切酶 ? 將目的基因與載體 DNA連接在一起，也需要工具酶－DNA連接酶。 ? 目前，許多廠商都在生產(chǎn)各種優(yōu)質(zhì)工具酶，簡(jiǎn)化了分子克隆操作，拓寬了基因工程的研究領(lǐng)域。 ? 世界大型工具酶生產(chǎn)廠商： （ 1） Novo Nordisk （ 諾和諾德公司，丹麥） （ 2） Gist Broccdes（ 荷蘭） （ 3） Cultot （ 科特公司，芬蘭） （ 4） Genencor International （ 杰能科公司，美國(guó)） （ 5） Solvay （ 蘇爾威公司，比利時(shí)） （ 6） Clr Hansen （ 漢森公司，丹麥） （ 7） Rhone Ponlene （ 羅蘭，普朗克公司，法國(guó)） （ 8） Quest （ 荷蘭） ? 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonucleases）：簡(jiǎn)稱工具酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶主要從原核生物中分離出來(lái)。 ? 僅 II型限制型核酸內(nèi)切酶已有 2022多種，可以識(shí)別 200多個(gè)不同的 DNA序列。 ? 細(xì)菌的限制 — 修飾作用 ? 1952年， Luria和 Human， ? 1953年， Bertani和 Weigle ? 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制（ restriction）現(xiàn)象： ? k ? Phageλ（ k） ? E .coli B『 E .coli B 限制 λ（ k） 』 感染 不感染 噬菌體侵染細(xì)菌 仍有少量 phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因?yàn)檫@些 phage對(duì)自身進(jìn)行了修飾。 大腸桿菌 K 大腸桿菌 B 普通的 phage λ (K) 修飾的 phage λ (K) 104（限制作用） 1 1 ? 細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制 — 修飾系統(tǒng) (RM Restrictionmodification system)。 ? RM系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌 RM系統(tǒng)的限制酶可以降解 DNA，為避免自身 DNA的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身 DNA，未被修飾的外來(lái) DNA則會(huì)被降解。 ? 個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。 ? 1968 Linn和 Arber從 B中發(fā)現(xiàn)限制酶 Ⅰ ? 1970 Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶 Ⅱ ? 1978 W. Arber， H. ， Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金 ? 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì) DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。 ? 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。 ? 根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的限制修飾活性、相對(duì)分子量大小、酶蛋白結(jié)構(gòu)、切割位點(diǎn)及限制作用所需的輔助因子等，將限制性核酸內(nèi)切酶分為三類： I型酶， II型酶，III型酶。 特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 限制和修飾活性 單一功能 單一功能 雙功能 識(shí)別與切割位點(diǎn) 分別，隨機(jī)切割，相距較遠(yuǎn) 同一位點(diǎn) 相距 510bp 對(duì)基因工程中意義 無(wú)用 非常有用 意義不大 EcoR I Escherichia 屬名 Coli 種名 Ry13 株系 編號(hào) 若種名頭 2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母 。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 ? 50μ L Buffer中，含 1μ g底物 DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫 1小時(shí)，能使 1μ g DNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用 U表示。 ? buffer （ pH=） ：
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