【正文】 2022年版 《 中國(guó)藥典 》 研討 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 顧炳仁 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 2 討 論 內(nèi) 容 ? 熱原檢查法 ? 異常毒性檢查法 ? 過(guò)敏反應(yīng)檢查法 ? 抗生素微生物檢定法 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 3 一、熱原檢查法 ? 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備 在作熱原檢查前 1～ 2日，供試用家兔應(yīng)盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于 5℃ ，實(shí)驗(yàn)室的溫度應(yīng)在 17～ 25℃ ，在試驗(yàn)全部過(guò)程中，應(yīng)注意室溫變化不得大于 3℃ ，避免噪音干擾。家兔在試驗(yàn)前至少 1小時(shí)開(kāi)始停止給食并置于適宜的裝置中，直至試驗(yàn)完畢。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 4 ? 結(jié)果判斷 在初試 3只家兔中，體溫升高均低于 ℃ ，并且 3只家兔體溫升高總和低于 ℃ ；或在復(fù)試的 5只家兔中，體溫升高 ℃ 或 ℃ 以上的兔數(shù)僅有 1只，并且初試、復(fù)試合并 8只家兔的體溫升高總和為 ℃ 或℃ 以下，均認(rèn)為供試品的熱原檢查符合規(guī)定。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 5 ? 在初試 3只家兔中，體溫升高 ℃ 或℃ 以上的家兔超過(guò) 1只；或在復(fù)試的 5只家兔中，體溫升高 ℃ 或℃ 以上的家兔超過(guò) 1只；或在初試、復(fù)試合并 8只家兔的體溫升高總和超過(guò) ℃ ，均認(rèn)為供試品的熱原檢查不符合規(guī)定。 ? 當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以 0.℃ 計(jì)。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 6 二、 異常毒性檢查法 ? 無(wú)實(shí)質(zhì)性修改內(nèi)容 ? 注意：環(huán)境條件 ? 動(dòng)物來(lái)源 ? 該法有被減少的可能 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 7 三、過(guò)敏反應(yīng)檢查法 ? 為新增方法 ? 本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內(nèi)，間隔一定時(shí)間后靜脈注射供試品進(jìn)行攻擊，觀察動(dòng)物出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的情況，以判定供試品是否引起動(dòng)物全身過(guò)敏反應(yīng)。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 8 ? 供實(shí)驗(yàn)用豚鼠應(yīng)健康合格，體重250～ 350g，雌鼠應(yīng)無(wú)孕。在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，均應(yīng)按正常飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。做過(guò)本實(shí)驗(yàn)的豚鼠不得重復(fù)使用。 ? 供試品溶液的配制 除另有規(guī)定外，均按各品種項(xiàng)下規(guī)定的濃度配制成供試品溶液。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 9 ? 檢查法 除另有規(guī)定外 ， 取上述豚鼠 6只 ， 隔日每只每次腹腔注射供試品， 共 3次 ， 進(jìn)行致敏 。 然后將其均分為 2組 ， 每組 3只 ， 分別在首次注射后第 14日和第 21日 ， 由靜脈注射供試品 1ml 進(jìn)行攻擊 。 每日觀察每只動(dòng)物的行為和體征 ， 首次致敏和攻擊前測(cè)定和記錄每只動(dòng)物的體重 。 觀察攻擊后 30分鐘內(nèi) ， 動(dòng)物有無(wú)豎毛 、 呼吸困難 、 抽搐等過(guò)敏反應(yīng)癥狀 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 10 ? 結(jié)果判定 ? 靜脈注射供試品后 30分鐘內(nèi) ， 不得出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng) 。 如有豎毛 、 噴嚏 、干嘔 、 連續(xù)咳嗽 3聲和呼吸困難等現(xiàn)象中的 2種或 2種以上 ， 或出現(xiàn)抽搐 、休克 、 死亡現(xiàn)象之一者 ， 判供試品不符合規(guī)定 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 11 四、 抗生素微生物檢定法 ? 本法系在適宜條件下 ， 根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì) ， 通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用 ， 計(jì)算抗生素活性 （ 效價(jià) ） 的方法 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 12 ? 抗生素微生物檢定法 包括兩種方法 ， 即管碟法和濁度法 。 ? 測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算所得的效價(jià) ， 如低于估計(jì)效價(jià)的 90％ 或高于估計(jì)效價(jià)的 110％ 時(shí) ， 應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià) ， 重新試驗(yàn) 。 ? 除另有規(guī)定外 ， 本法的可信限率不得大于 5％ 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 13 ? 第一法 管碟法 ? 本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用 ， 比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小 ， 以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 14 ? 第二法 濁度法 ? 本法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用 ， 通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小 ，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度 ， 以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 15 ? 菌懸液制備 ? 金黃色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus） 懸液 取金黃色葡萄球菌〔 CMCC（ B） 26 003〕 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物 ， 接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上 ， 在 35～ 37℃ 培養(yǎng) 20～ 22小時(shí) 。臨用時(shí) ， 用滅菌水或 0. 9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下 ， 備用 。 ? 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 16 ? 大腸桿菌（ Escherichia coli）懸液 ? 取大腸桿菌 〔 CMCC（ B） 44 103〕 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在 35～37℃ 培養(yǎng) 20～ 22小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 17 ? 白色念珠菌（ Candida albicans）懸液 ? 取白色念珠菌 [CMCC(F)98001]的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于 10ml培養(yǎng)基 IX中，置 35～ 37℃培養(yǎng) 8小時(shí)，再用培養(yǎng)基 IX稀釋至適宜濃度，備用 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 18 ? 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 ? 標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)的規(guī)定。臨用時(shí)照各品種項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行稀釋。 ? 標(biāo)準(zhǔn)品的品種、分子式及理論計(jì)算值見(jiàn)表 2。 ? 供試品溶液的制備 精密稱（或量）取供試品適量，照各品種項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行供試品溶液的配制。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 19 ? 含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前 ， 取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（ 35～ 37℃ 培養(yǎng) 3～ 4小時(shí)后測(cè)定的吸收值在 ～ ， 且劑距為 2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于） ， 加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中 ， 混合 ， 使在試驗(yàn)條件下能得到滿意的劑量－反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度 。 ? 已接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基應(yīng)立即使用 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 20 ? 藥典濁度法設(shè)計(jì)表 ? 慶大霉素 ? 金黃色葡萄球菌 ? 培養(yǎng)基 III pH值 液 pH值 單位 /ml培養(yǎng)條件 3537 ℃ 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 21 ? 檢定法 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：除另有規(guī)定外 ， 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管 ， 在各品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi) ，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度 ， 標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇 5個(gè)劑量 ， 劑量間的比例應(yīng)適宜 （ 通常為 1:小 ） ， 供試品根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量溶液選擇中間劑量 ， 每一劑量不少于3個(gè)試管 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 22 ? 在各試驗(yàn)管內(nèi)精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基 ， 再分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液各 ， 立即混勻 ， 按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測(cè)量的濁度值（ 通常約為 4小時(shí) ） ， 在線測(cè)定或取出立即加入甲醛溶液 （ 1→ 3） 終止微生物生長(zhǎng) ， 在 530nm或 580nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 23 ? 同時(shí)另取 2支試管各加入藥品稀釋劑 ， 再分別加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基 ， 其中一支試管與上述各管同法操作作為細(xì)菌生長(zhǎng)情況的陽(yáng)性對(duì)照 ， 另一支試管立即加入甲醛溶液 ， 混勻 ， 作為吸光度測(cè)定的空白液 。 照標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)和效價(jià)計(jì)算 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 24 ? 效價(jià)的計(jì)算 求出各劑量點(diǎn)的吸收度平均值 ， 以劑量－吸收度平均值求出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程 ? Y=bX+a ? 其中 Y為吸收度平均值 ， X為抗生素濃度 （ 或濃度的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值 ） ? 供試品的效價(jià) 計(jì)算供試品吸收度的平均值 ， 代入線性方程求得抗生素的量 ，再乘于供試品的稀釋度 ， 即得供試品中抗生素的量 。 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 25 ? 二劑量法或三劑量法： ? 除另有規(guī)定外 ， 取大小一致的已滅菌的試管 ， 在各品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi) ， 選擇適宜的高 、 （ 中 、 ） 低濃度 ，分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各 ， 二劑量的劑距為 2： 1 或 4： 1，三劑量的劑距為 1： 。 同標(biāo)準(zhǔn)曲線法操作 ， 每一濃度組不少于 4個(gè)試管 ， 按隨機(jī)區(qū)組分配將各試管在規(guī)定條件下培養(yǎng) 。 照生物檢定統(tǒng)計(jì)法 （ 附錄 XIV） 中的 （ ）和 （ ） 法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算 。 2022年版 《 中國(guó)藥典 》 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法簡(jiǎn)介 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 27 中國(guó)藥典 2022版細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查法 方法 1 凝膠法 A、凝膠限量試驗(yàn) B、凝膠半定量試驗(yàn) 方法 2 光度測(cè)定法 A、濁度法 B、顯色基質(zhì)法 。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法 ?1 基本概念 和發(fā)展 ?2 凝膠限量試驗(yàn) ?3 鱟試劑靈敏度復(fù)核 ?4 干擾試驗(yàn) ?5 凝膠半定量試驗(yàn) ?6 光度測(cè)定法 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 29 1 基本概念 和發(fā)展 熱原的分類 熱原的檢測(cè)方法 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（ BET） BET技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展 1. 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 30 熱原的分類 ? 外源性熱原 ? 內(nèi)源性熱原 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 31 – 外源性熱原 ? 內(nèi)毒素?zé)嵩? ——革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分，脂多糖(LPS) ? 非內(nèi)毒素?zé)嵩? ——除內(nèi)毒素外的熱原（病毒、細(xì)菌、真菌、抗體 抗原復(fù)合物、