目的基因的分離和克隆(已修改)
2025-05-30 23:55 本頁面
【正文】 第四章 目的基因 的分離和克隆 ? 第一節(jié) 目的基因的獲得 ? 第二節(jié) 獲得目的基因方法的選擇 ? 第三節(jié) 目的基因重組體的構(gòu)建 第一節(jié) 目的基因的獲得 ? 一、化學(xué)合成 ? 二、聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 方法擴增目的基因 ? 三、建立基因組 DNA文庫 ? 四、 構(gòu)建 cDNA文庫篩選目的基因 ? 五、 其他方法 一、 化學(xué)合成法 自動化 DNA合成儀 ? ： 1） 已知目的基因的核苷酸序列或其對 應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列 ? 2）較短的 DNA片段，有專一性和定向性 ? ：第一個核苷酸固定于不溶性的固相載 體上 , 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開始，以 3’、5’磷酸二酯鍵與另一核苷酸進行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團 ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物 , 再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行縮合反應(yīng) , 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來 , 解除保護基 , 進一步純化。 ? 應(yīng)用范圍： 1）合成 PCR引物 ? 2）寡核苷酸探針 ? 3）人工接頭及較小的基因 二、建立基因組 DNA文庫 基因組文庫 ：分離真核生物中某種 DNA成分 , 通常是分離供體細胞中的染色體 DNA，酶切后，將這些染色體 DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細胞染色體 DNA片斷的克隆株 , 這種克隆株群體。 ：提供全套遺傳信息 , 即完整的基因組DNA,可以研究基因組中 5’端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列 , 內(nèi)含子的分布和作用 , 以及重復(fù)序列的數(shù)量分布及大小 （ DNA重組的過程 ） ⑴ 分離純化基因組 DNA, 提取哺乳動物細胞染色體 DNA ⑵ 制備全部基因組的 DNA片斷 ①機械斷裂 法 用超聲波或高速攪拌 DNA溶液 斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端 , 因此插入載體之前還需要進行修飾加工，少用 ②限制性內(nèi)切酶降解（鳥槍法） 過去用 EcoRⅠ ,現(xiàn)在用 Sau3A 斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過的載體連接。 ? ⑶ DNA片斷與載體的連接包裝 ? 常用載體：粘性質(zhì)粒 λ噬菌體 ?
法律信息相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1