【正文】 項(xiàng)目名稱： 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 桂建芳 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門(mén)： 中國(guó)科學(xué)院 湖北省科技廳 一、研究?jī)?nèi)容 基于擬解決的魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這 兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題， 本項(xiàng)目擬集中在魚(yú)類(lèi)主要經(jīng)濟(jì)性狀如生殖、生長(zhǎng)、抗性 的功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)方面， 重點(diǎn)解析這些主要經(jīng)濟(jì)性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開(kāi)拓關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究?jī)?nèi)容包括： 1） 魚(yú)類(lèi)生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 及其分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點(diǎn)解析魚(yú)類(lèi)生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機(jī)制；探討魚(yú)類(lèi)配子發(fā)生過(guò)程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；通過(guò)大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個(gè)體間性別特異的 DNA 片段標(biāo)記，進(jìn)而通過(guò) Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關(guān)基因；揭示魚(yú)類(lèi)性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開(kāi)拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 2） 魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點(diǎn)解析魚(yú)類(lèi)下丘腦/垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚(yú)類(lèi)性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)肌肉細(xì)胞增殖和魚(yú)肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系；闡明魚(yú)類(lèi)個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開(kāi)拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 3） 魚(yú)類(lèi)抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚(yú)類(lèi)抗病毒基因的細(xì)胞模型，重點(diǎn)解析魚(yú)類(lèi)干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示重要魚(yú)類(lèi)病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；探討在魚(yú)類(lèi)抗病免疫反應(yīng)中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機(jī)理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚(yú)類(lèi)抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚(yú)類(lèi)抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法，開(kāi)拓其可行性途徑。 采用大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚(yú)類(lèi)抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚(yú)類(lèi)基因表達(dá)譜與耐寒魚(yú)類(lèi)基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚(yú)類(lèi)抗寒機(jī)理研究模型，開(kāi)拓魚(yú)類(lèi)抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過(guò)建立魚(yú)類(lèi)數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們?cè)谌后w和家系中的功能，確定魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 通過(guò)創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚(yú)類(lèi)基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 二、預(yù)期目標(biāo) 本項(xiàng)目的總體目標(biāo)： 針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過(guò)開(kāi)展重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性等主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組研究，解析魚(yú)類(lèi)生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚(yú)類(lèi)抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的主控或關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，提出魚(yú)類(lèi)良種分子設(shè)計(jì)的策略；在技術(shù)方法上，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。通過(guò)這些研究，使我國(guó)在魚(yú)類(lèi)功能基因組研究中居國(guó)際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 解析魚(yú)類(lèi)生殖、 生長(zhǎng)、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、 可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的功能基因和分子標(biāo)記 30－ 50 個(gè) ； 3. 揭示魚(yú)類(lèi)性別決定與分化、卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制； 4. 闡明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素分泌的信號(hào)通路； 5. 闡明魚(yú)類(lèi) 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機(jī)理；闡明魚(yú)類(lèi)抗寒關(guān)鍵信號(hào)通路及其作用機(jī)理； 6. 建立魚(yú)類(lèi)數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計(jì)和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目 標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國(guó)際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人 和學(xué)術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，其中在有重要國(guó)際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 三、研究方案 （一）、學(xué)術(shù)思路： 針對(duì) 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對(duì)象，啟動(dòng)我國(guó) 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究， 通過(guò)研究魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，為魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐和應(yīng)用以及為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測(cè)序等大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解魚(yú)類(lèi)生殖和生長(zhǎng)不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達(dá)譜差異，經(jīng)生物信息學(xué)比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚(yú)類(lèi)基因組 BAC 庫(kù)，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應(yīng)基因的啟動(dòng)子；將其啟動(dòng)子與 GFP 報(bào)告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀等篩選分析技術(shù)，進(jìn)一步研究生物學(xué)功能； 3. 建立魚(yú)類(lèi) BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當(dāng)位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚(yú)，通過(guò) EGFP 分析這些基因的時(shí)空表達(dá)情況及其生理學(xué)效應(yīng)； 4. 通過(guò)基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)序性 。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin i