【正文】 項目名稱： 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設計育種的基礎研究 首席科學家： 桂建芳 中國科學院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國科學院 湖北省科技廳 一、研究內(nèi)容 基于擬解決的魚類分子設計育種的策略和理論基礎以及魚類分子設計育種的 可行性途徑這 兩個 關鍵科學問題， 本項目擬集中在魚類主要經(jīng)濟性狀如生殖、生長、抗性 的功能基因組和分子設計育種的基礎方面， 重點解析這些主要經(jīng)濟性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡，開拓關鍵技術(shù)，其主要研究內(nèi)容包括： 1） 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡 及其分子設計育種的基礎研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚類卵母細胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機制；探討魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡；通過大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個體間性別特異的 DNA 片段標記，進而通過 Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關基因；揭示魚類性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理；篩選鑒定出可用于魚類分子設計育種的性別特異表達基因和分子標記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標記用于魚類分子設計育種的可行性途徑。 2） 魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 采用 morpholino 介導的基因敲降、整體原位雜交、細胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點解析魚類下丘腦/垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機理；探討腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關基因在調(diào)控魚類肌肉細胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子標記尤其是主控基因用于魚類分子設計育種的可行性途徑。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細胞模型，重點解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡和抗病作用機理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；探討在魚類抗病免疫反應中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡、功能和抗病機理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設計育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑。 采用大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達譜與耐寒魚類基因表達譜的差異及其關鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設計育種的可行性途徑。 4）魚類分子設計育種的關鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟性狀主效基因同線性和性狀關聯(lián)性關系，闡明魚類經(jīng)濟性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟性狀主效基因標記和基因不同組合的遺傳效應，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設計育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設計、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚類分子設計育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長激素受體基因與轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應及其信號通路的調(diào)控差異。 二、預期目標 本項目的總體目標： 針對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過開展重要養(yǎng)殖魚類生殖、生長和抗性等主要經(jīng)濟性狀的功能基因組研究，解析魚類生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡、魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡、魚類抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡，篩選鑒定進行分子設計育種的主控或關鍵基因和分子標記，建立魚類分子設計育種的關鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚類生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理，提出魚類良種分子設計的策略；在技術(shù)方法上，建立魚類分子設計育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚類分子設計育種的可行性途徑。通過這些研究，使我國在魚類功能基因組研究中居國際領先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻。 五年預期目標 : 1. 解析魚類生殖、 生長、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡； 2. 篩選鑒定 具有自主知識產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設計育種的功能基因和分子標記 30－ 50 個 ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機制； 4. 闡明魚類生長激素分泌的信號通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機理；闡明魚類抗寒關鍵信號通路及其作用機理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設計和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟性狀功能基因組研究和分子設計育種中間的有機聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個在生殖、生長 或抗性等目 標經(jīng)濟性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國際影響的中青年學術(shù)帶頭人 和學術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學術(shù)論文，其中在有重要國際影響的期刊（ 相關領域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 三、研究方案 （一）、學術(shù)思路： 針對 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對象，啟動我國 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設計育種的基礎研究， 通過研究魚類生殖、生長和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理，篩選鑒定進行分子設計育種的關鍵基因和分子標記，建立魚類分子設計育種的關鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚類分子設計育種的策略和理論基礎以及魚類分子設計育種的 可行性途徑這兩個 關鍵科學問題，為魚類分子設計育種的實踐和應用以及為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測序等大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學分析，了解魚類生殖和生長不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達譜差異，經(jīng)生物信息學比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長、抗性的主要基因和關鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應基因的啟動子；將其啟動子與 GFP 報告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細胞儀等篩選分析技術(shù)，進一步研究生物學功能； 3. 建立魚類 BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時空表達情況及其生理學效應； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測基因表達的組織特異性和時序性 。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細胞和亞細胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin i