【正文】 第六章 檢疫性細(xì)菌病害 植物檢疫性病原細(xì)菌的檢驗(yàn)方法 梨火疫病 Fire Blight 玉米細(xì)菌性枯萎病 Stewart’s bacterial wilt of corn 柑橘黃龍病 Citrus Yellow shoot 椰子致死黃化病 Coconut Lethal Yellowing 復(fù)習(xí)思考題 植物病原細(xì)菌檢疫檢驗(yàn)技術(shù) ? 直接檢測：直觀檢驗(yàn)和生長檢驗(yàn) ? 間接檢測 活菌檢測 免疫吸附分離法 噬菌體檢驗(yàn) 非活菌檢測 血清學(xué)檢測 活菌檢測 ? 分離培養(yǎng)法：營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基分離純化得到的細(xì)菌 ? 濃縮接種及離體葉檢測：提取液濃縮接種感病植物，觀測發(fā)病情況。 例如：浙江大學(xué)等在 1％滅菌水瓊脂中加75 10－ 6的苯并咪唑，做平板，加感病植物葉片，針刺＋摩擦接種，培養(yǎng)（光、溫、濕度），短期獲得癥狀。主要應(yīng)用于水稻細(xì)菌性條斑病菌和小麥細(xì)菌性黑穎病菌的檢測。 ? 原理：接合血清學(xué)與平板分離技術(shù)，利用與抗原高度親和性的抗體，來捕獲目標(biāo)細(xì)菌，樣本中其他細(xì)菌均被沖洗掉，再將目標(biāo)細(xì)菌轉(zhuǎn)移或釋放到培養(yǎng)基上生長。 ? 方法：平皿免疫吸附評價測定法和免疫吸附稀釋培養(yǎng)法 平皿免疫吸附評價測定法簡略流程如下： 常用溶入丙酮的硝酸纖維素或指甲油作包被 洗滌液使用包被緩沖液 ? 原理：噬菌體侵染細(xì)菌，裂解寄主細(xì)胞，在液體培養(yǎng)時，會使渾濁的細(xì)菌懸浮液變清，在固體平板上培養(yǎng)，則出現(xiàn)許多邊緣整齊、透明光亮的噬菌斑。噬菌體具有專化性，利用此特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌的種類。 ? 非活菌檢測的方法很多，下表是檢測病原細(xì)菌常用的一些方法，前 9種血清學(xué)方法，均屬非活菌檢測。它們既能用于病原鑒定，又能直接用于病種或病株，甚至是無癥感染組織的檢測。 ? 原理： ? 方法：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ ELISA）、免疫熒光抗體法 ? 免疫熒光抗體法：將熒光染料（異硫氫酸熒光黃或羅丹明）與抗體以化學(xué)方法接合，再與抗體反應(yīng)，形成有熒光標(biāo)記的抗體 — 抗原復(fù)合物，在熒光顯微鏡下，可觀察到黃綠色熒光。 梨火疫病 Fire blight of pear ?分布 ： 1878年首先由 burrill描述，在紐約發(fā)生，后由 Erwin命名，是第一個被確定的植物細(xì)菌病害。主要分布于北美洲于西北歐，中歐、地中海、東南歐及大洋州和亞洲也有分布。大約 40多個國家。 梨火疫病的地理分布 ?寄主： 梨火疫病菌寄主范圍很廣，能為害梨、蘋果、山楂、木旬子、李等４０多個屬 220多種植物，大部分屬薔薇科 Pomoideae亞科。 ?危害性： 仁果類果樹的一種毀滅性病害。一棵多年生的梨和蘋果樹發(fā)病后可在幾星期內(nèi)死亡 ? 癥狀： 侵害花、果實(shí)、枝條和葉片。 ① 花 :侵染后變深褐色，枯萎。 ② 葉片 :從葉緣沿葉脈擴(kuò)展，先呈水浸狀，后黑褐色。 ③ 嫩稍 :先水浸狀，后褐色至黑色，向下彎曲，呈魚鉤狀。 ④ 果實(shí)：病部褐色凹陷，擴(kuò)展到全果，潮濕時病部生粘稠的細(xì)菌溢，初乳白色，后紅褐色。 ⑤ 病枝 :葉片凋萎，幼果僵化，但病葉病果不脫落，遠(yuǎn)望似火燒狀，故稱火疫病。 ⑥ 傷口：初期水浸狀，后下陷，呈潰瘍斑，病健交界處產(chǎn)生龜裂紋，韌皮部紅褐色，有黏液狀菌膿。 嚴(yán)重時，病害從嫩稍很快擴(kuò)展到枝條、主干，直至根部，全株死亡。 Advanced fire blight on fruit note bacterial ooze on fruit. Fireblight in nursery stock ?主要鑒定特征： 梨火疫病最典型的癥狀是花、果實(shí)和葉片受火疫病菌侵害后，很快變黑褐色枯萎，猶如火燒一般，但仍掛在樹上不落，故此得名。目前國際上將其癥狀據(jù)受侵害的部位，分成５個階段。 （ 1）花枯萎：侵染開放的花引起花枯萎。一般發(fā)生于早春，病菌直接從花器侵入，初為水漬狀斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可擴(kuò)展至花梗及花簇中其它的花；在溫曖潮濕條件下，花梗上有菌膿滲出。隨著枯萎發(fā)展，花梗、花等變褐至黑褐色，條件適宜時可繼續(xù)侵染殺死小枝并形成小潰瘍斑。 （ 2）潰瘍枯萎：是指前一季越冬潰瘍邊緣的病菌重新復(fù)活的結(jié)果。初癥是在復(fù)活的潰瘍附近的健康樹皮組織上出現(xiàn)窄的水漬狀區(qū)，幾天后，樹皮內(nèi)部組織出現(xiàn)褐色條斑，隨后病菌侵入附近繁殖枝內(nèi)部并引起萎蔫死亡。這些枝條特別是嫩枝與下面談及的枝枯萎有明顯區(qū)別，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黃至桔黃色）。 （ 3）枝枯萎：細(xì)菌直接侵入前 1～ 3葉的枝尖，然后殺死整個枝條及支持枝。初癥是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖狀。條件適宜時，幾天內(nèi)可移動 15～ 30cm，造成整枝死亡，病枝、枝皮、葉通常變黑。潮濕時，枝條上出現(xiàn)菌膿。后期，終芽前出現(xiàn)的枝枯萎一般不會萎蔫，且僅在枝最上部出現(xiàn)壞死。隨著病菌不斷深入，并侵染主干，皮層收縮，下陷，形成潰瘍斑。 （ 4）病菌亦可直接從氣孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由風(fēng)引起的傷口侵入葉片，初葉邊壞死，并向中脈、中柄、莖擴(kuò)展，后變黑，通常有菌膿。 （ 5）損傷枯萎和砧木枯萎：這二種比較特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大風(fēng)損傷引起，如果實(shí) 很容易引起果實(shí)枯萎。后者僅限于高感品種 EMAL2 EMLA9和 MARK39砧木。通常是由感病的接穗在這些砧木上發(fā)病后引起，最終成潰瘍帶而殺死樹體。 ?病原菌： 學(xué)名： Erwinia amylovora（ Burrill） Winslow 異名： Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester 分類地位：原核生物界 (Procaryotes),薄壁菌門(Gracilicutes),腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)歐文氏菌屬 (Erwinia)解淀粉歐文氏菌 ?形態(tài)特征： 直桿菌，有莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動，大小為 ，多數(shù)單生，有時成雙或短時間內(nèi) 34個呈鏈狀。革蘭氏染色陰性。在蔗糖培養(yǎng)基上 27℃ 下培養(yǎng) 3d，菌落直徑 3～ 4mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，邊緣整齊，中心絨環(huán)狀。 ?生物學(xué)特性： 兼性厭氧，過氧化物酶陽性，氧化酶陰性，好氣條件下利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，厭氧條件產(chǎn)酸緩慢。明膠碟形液化緩慢。不產(chǎn)生硫化氫，不利用丙二酸鹽。葡萄糖酸鹽氧化和七葉苷水解不穩(wěn)定。氯化鈉濃度高于 2％以上時生長延緩，至 6％－ 7%時則完全抑制。 抗青霉素，對氯霉素、鏈霉素和土霉素敏感。 細(xì)菌生長的溫度范圍 6～ 37 ℃ ，最適溫度 25～ ℃ ，致死溫度 45～ 50℃ ， 10 min，最適酸堿度為 。 梨火疫病菌以簡單的細(xì)胞分裂繁殖，一個細(xì)胞在條件適宜時，３天內(nèi)在寄主植物組織中能達(dá)到 10