腫瘤的分子診斷-文庫吧
2025-11-05 22:16 本頁面
【正文】 切相關(guān)。,基因缺失中較為頻發(fā)的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因雜合型和純合型丟失。 基因缺失是腫瘤形成的原因還是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果，尚值得深入探討。,（三）基因異位或重排 （gene translocation and rearrangement） 某一基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個位置上稱為易位或重排。易位與重排易使癌基因被激活，或是抑癌基因失活，從而使細(xì)胞惡變。 細(xì)胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進(jìn)子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時，可使細(xì)胞癌基因于正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。,(四) 其它類型的基因突變 插入 甲基化 染色體非組蛋白改變 等 癌基因或抑癌基因甲基化（methylation） 狀態(tài)改變與腫瘤發(fā)生存在密切關(guān)系。,二、基因突變的檢測方法 目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立在PCR的基礎(chǔ)上，由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，自動化程度越來越高，分析時間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有了很大提高。,（一） PCRSSCP法 單鏈構(gòu)像多態(tài)性 (singlestrand conformational polymorphism, SSCP) 基本原理： 單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其堿基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上移動速度改變，不同的二級結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)不同的遷移象。,該法不能測定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過序列分析來確定。對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其靈敏度。 該法簡單快速，被廣泛用于未知基因突變的檢測。由于該法的簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。 應(yīng)用PCRSSCP檢測點(diǎn)突變已見報(bào)道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法。,（二）雜合雙鏈分析法 （heterodulex analgsis, HA） 直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。 HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，二者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高近100%。,（三）突變體富集PCR （mutantenriched PCR） 利用癌基因或抑癌基因某個編碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴(kuò)增包括存在酶位點(diǎn)編碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。,（四）變性梯度凝膠電泳法 （denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE） 雙鏈DNA在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠中自上而下所含變性劑濃度線性增長，DNA片段進(jìn)行到變性劑某一濃度，與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，但解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同時間解鏈，則因影響電泳速度變化的程度而被分離。,在DGGE基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用溫度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE），由于DGGE和TGGE是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，均需專用的電泳裝置。,（五）化學(xué)切割錯配法 （Chemical cleavage of mismatch,CCM） 基本原理： 將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。,該法檢出率很高，也是檢測片段最長的方法。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度。該法中的化學(xué)試劑有毒，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測法（Carbodiimide，CDI），CDI為無毒物質(zhì)。,（六）等位基因特異性寡核苷酸分析法 (allelespecific oligonucleotide ASO) 設(shè)計(jì)一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR擴(kuò)增的樣品DNA雜交。 可以選用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表示樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變。,（七）DNA芯片技術(shù)（DNA Chip） 基本原理： 將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一塊固體材料如玻璃片、硅片（集成電路板）上，彼此之間重疊一個堿基，并覆蓋所需測定的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交，由于至少存在一個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變。 可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等，在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景。,（八）RNA酶A切割法 制備RNA探針，與待測DNA或RNA片段雜交，在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA ：RNA或RNA ：DNA的錯配堿基可被RN
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