【正文】 1）。圖總體學(xué)術(shù)思路我們將對多能干細(xì)胞分化成的三種模式細(xì)胞譜系進(jìn)行研究，包括神經(jīng)外胚層和心血管中胚層在內(nèi)的兩類體細(xì)胞以及生殖細(xì)胞。利用并優(yōu)化現(xiàn)有的分化手段來建立分化的模式細(xì)胞系，研究和比較它們在未分化及分化狀態(tài)下的信號通路、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和染色質(zhì)水平上的調(diào)控，建立以表觀遺傳調(diào)控為中心的涉及蛋白、DNA和RNA 相互作用及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（通稱為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)）。同時，我們將建立報告基因與基因敲入、敲除的小鼠品系，通過分離體內(nèi)干細(xì)胞, 從個體發(fā)育的角度深入研究以表觀遺傳調(diào)控為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何控制動物體內(nèi)的神經(jīng)、心血管和生殖系統(tǒng)細(xì)胞的形成。比較不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的機(jī)制的共通點(diǎn)和特異性。不僅要找到更多控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子, 并且全面綜合地認(rèn)識它們?nèi)绾巫饔糜诒碛^遺傳學(xué)修飾機(jī)制，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終決定細(xì)胞譜系及功能。通過比較人與小鼠同類細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制的異同, 從進(jìn)化的角度理解這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的演變。本項目的立項將為我們?nèi)斯げ倏丶?xì)胞命運(yùn)提供新的線索和理論依據(jù)，并將最終促進(jìn)細(xì)胞療法的臨床運(yùn)用。２、技術(shù)途徑我們將利用最前沿的技術(shù)平臺，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)方法，全面系統(tǒng)及深入地認(rèn)識控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的分子及表觀遺傳機(jī)制。依據(jù)體內(nèi)組織器官發(fā)生的規(guī)律，我們將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，通過組織特異性熒光蛋白報告細(xì)胞系及表面抗原，分離純化各分化階段的神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞，初步建立一個穩(wěn)定的高效誘導(dǎo)分化方案，為研究分子機(jī)制提供細(xì)胞基礎(chǔ)。PRC2主導(dǎo)的H3K27的三甲基化（H3K27me3）代表一類重要的表觀遺傳抑制機(jī)制。它們調(diào)控幾乎所有與干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的發(fā)育過程，包括神經(jīng)、心血管及生殖器官的形成，對ESCs的分化起不可缺少的作用。因此，我們將以PRC2為中心，研究表觀遺傳學(xué)調(diào)控在多能干細(xì)胞定向分化和胚胎發(fā)育中的作用。我們將用一種新的手段，利用生物素（biotin）和FLAG雙標(biāo)計內(nèi)、外源的PRC2, 來對PRC2復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)（tandem protein plex purification coupled with mass spec microsequencing）、基因組學(xué) (RNAseq、ChIPseq和RIPseq)、分子及細(xì)胞、生物化學(xué)的分析。我們首先利用人和小鼠ESCs的分化模型，研究PRC2在神經(jīng)、心血管和生殖系統(tǒng)中如何與蛋白、RNA和DNA結(jié)合和相互作用。在利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的同時，我們將建立基因敲入的（knockin）小鼠品系，表達(dá)受內(nèi)源啟動子控制的生物素 (biotin) 和FLAG雙標(biāo)計的PRC2蛋白, 為研究動物體內(nèi)胚胎發(fā)育、器官形成的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)平臺。此外，利用我們在小鼠PRC2表觀遺傳學(xué)和microRNA系統(tǒng)方面的優(yōu)勢，我們將建立一系列轉(zhuǎn)基因小鼠品系，使它們既有神經(jīng)、心血管或生殖細(xì)胞特異性熒光蛋白報告體系，也同時表達(dá)帶標(biāo)記的PRC2組分或條件性microRNA全敲除系統(tǒng)，研究表觀遺傳調(diào)控和microRNA在體內(nèi)發(fā)育中的作用。對以上體外、體內(nèi)不同分化模型及小鼠早期胚胎發(fā)育，利用單、多細(xì)胞microRNA和轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)（singlecell RNAseq），全面分析多能干細(xì)胞在體內(nèi)、外定向分化過程中全基因組水平的蛋白編碼基因、ncRNA和microRNA的表達(dá)。利用ChIPSeq技術(shù)分析重要表觀遺傳修飾譜（包括H3K27me3）。此外，我們將對幾個在神經(jīng)、生殖系統(tǒng)特異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白（包括Musahi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等）進(jìn)行RNA免疫共沉淀和高通量測序分析（RIPseq），來篩選調(diào)控神經(jīng)、生殖系統(tǒng)分化的重要ncRNA, 闡明它們的生理功能。通過分析不同分化階段各類細(xì)胞的mRNA、microRNA和ncRNA表達(dá)譜、PRC2靶區(qū)域和結(jié)合蛋白及ncRNA，以及表觀遺傳修飾譜，利用系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法，整合以上信息，建立以表觀遺傳調(diào)控為中心的涉及蛋白質(zhì)、DNA和RNA 相互作用及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的四維表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從宏觀系統(tǒng)水平上全面、動態(tài)地認(rèn)識信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和表觀遺傳因子之間的相互作用，它們?nèi)绾谓閷?dǎo)表觀遺傳學(xué)酶機(jī)器PRC2的募集和表觀遺傳標(biāo)記的建立，以及這些互作對基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的影響。構(gòu)建在不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過比較這些網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識它們的共通點(diǎn)和特異性，尋找影響定向分化的網(wǎng)絡(luò)中心或節(jié)點(diǎn)，篩選出更多的控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，包括信號因子、轉(zhuǎn)錄因子、microRNA、ncRNA和表觀遺傳因子。結(jié)合過表達(dá)、RNA干擾及基因敲除等技術(shù)，研究關(guān)鍵因子在分化過程中的功能及它們與表觀遺傳機(jī)制的相互作用。包括轉(zhuǎn)錄因子、microRNA和ncRNA是如何控制表觀遺傳機(jī)制來建立特定的表觀遺傳狀態(tài)，而表觀遺傳機(jī)制又是如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)的。通過比較人和小鼠多能干細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子、microRNA和表觀遺傳機(jī)制互作網(wǎng)絡(luò)的異同, 從進(jìn)化角度深入理解表觀遺傳為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在干細(xì)胞分化過程中的作用。最后，我們將把研究成果轉(zhuǎn)化到人類ESCs定向分化的體系中, 優(yōu)化培養(yǎng)條件，利用mRNA 轉(zhuǎn)染、化學(xué)小分子誘導(dǎo)等先進(jìn)技術(shù)，爭取最大限度地提高人類多能干細(xì)胞向各種神經(jīng)、心血管和生殖組織定向分化的效率和安全性，并通過動物移植模型驗(yàn)證分化細(xì)胞的功能。課題設(shè)置本項目運(yùn)用人和小鼠的多能干細(xì)胞，構(gòu)建及比較不同分化系統(tǒng)和體內(nèi)、外發(fā)育模型的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)和分子水平上研究控制多能干細(xì)胞向不同方向分化的分子機(jī)制，通過認(rèn)識調(diào)控機(jī)制的共通點(diǎn)和特異性，找到更多控制細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子，并且深入研究它們?nèi)绾巫饔糜诒碛^遺傳修飾機(jī)器，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)和最終決定細(xì)胞譜系及功能。最后，研究如何通過操控決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子或機(jī)制，提高人類多能干細(xì)胞向各種神經(jīng)、心血管和生殖細(xì)胞分化的效率和安全性?；谶@樣的思路，同時考慮項目團(tuán)隊成員的研究方向的共性，我們設(shè)置四個課題： （１）多能干細(xì)胞向體細(xì)胞（包括神經(jīng)外胚層及心血管中胚層）分化模型及調(diào)控機(jī)制；（２）多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化模型及調(diào)控機(jī)制；（３）表觀遺傳學(xué)調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作用；（４）轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在干細(xì)胞定向分化中的作