【正文】 %、 CaCl22H2O %、 (NH4) 2 SO4 %、 Tween80 %（體積比 ），121℃ 下滅菌 30min 后使用。 菌種活化后按 7%的接種量接種到一級(jí)種子罐中通氣培養(yǎng)，培養(yǎng) 48h 后 再 接種至二級(jí)種子罐中，培養(yǎng) 48h 后按 7%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵 [6]。 （二）發(fā)酵過程 （ 1）發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 ① 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 [5] 玉米秸稈粉 %、麥麩 5%、酵母膏 %、蛋白胨 %、 MgSO47H2O %、 7 KH2PO4 %、 CaCl22H2O % 、 (NH4) 2SO4 % 、 Tween80 %（體積比 ）， 121℃下滅菌 30min 后使用。 ② 配制培養(yǎng)基的注意事項(xiàng) [1] I．碳源 纖維素酶發(fā)酵大多采 用含有纖維素的原料作為碳源。一般是將玉米秸稈粉碎至 20 目以下后與麥麩等其他輔料混合。麥麩對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響是雙面的：它一方面為產(chǎn)酶提供必要的生長(zhǎng)因子；另一方面，其含量增加又會(huì)降低培養(yǎng)基的蓬松程度，使通氣量降低，從而影響產(chǎn)酶。對(duì)于里氏木霉，當(dāng)玉米秸稈與麥麩之比為 4:1 時(shí)纖維素酶的產(chǎn)量最高[7]。 II．氮源 可用無機(jī)氮，也可用有機(jī)氮，二者差別不大。里氏木霉的最適氮源為硫酸銨和谷氨酸鈉，硫酸銨價(jià)格較便宜，因此選用硫酸銨，用 %濃度效果較佳。 III. 細(xì)胞通透性 增加細(xì) 胞通透性對(duì)提高纖維素酶活性有一定的作用。一般認(rèn)為Tween80 可以提高里氏木霉的纖維素酶的產(chǎn)量 ， 添加量為 %。 培養(yǎng)基的配制是在拌料罐中進(jìn)行的。預(yù)先在拌料罐中添加所需質(zhì)量的各種成分，然后加入培養(yǎng)基中所有用水量的 60%左右，使最終兩個(gè)發(fā)酵罐中的裝料量為 m3。用攪拌槳攪勻后用往復(fù)泵泵 入 兩個(gè)發(fā)酵罐中。 （ 2）發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌 [8] 由于發(fā)酵罐的體積較小，因此可采用實(shí)罐滅菌的方式進(jìn)行滅菌。滅菌過程采用 蒸汽壓為 196kPa（表壓）的蒸汽通入發(fā)酵罐中，利用蒸汽冷凝釋放的熱量加熱培養(yǎng)基，以達(dá)到滅菌的目的 。實(shí)罐滅菌過程共分為三個(gè)階段： ① 升溫階段 采用直接將活蒸汽通入發(fā)酵罐中的方式把培養(yǎng)基由室溫加熱到滅菌溫度。此過程中通入的蒸汽冷凝形成的水可直接補(bǔ)充配制培養(yǎng)基時(shí)未加足的水。 ② 保溫階段 蒸汽從與培養(yǎng)基相接觸的管道連續(xù)進(jìn)入，從不與培養(yǎng)基相接觸的管道連續(xù)排出。維持一定的滅菌時(shí)間，以到達(dá)滅菌的目的。 ③ 冷卻階段 完成保溫時(shí)間后，關(guān)一路排汽，再關(guān)一路進(jìn)汽（次序不能顛倒），最后排汽與進(jìn)汽全部關(guān)閉。然后引入無菌空氣，再打開 蛇管的冷卻水，使培養(yǎng)基的溫度降低到合適的溫度，以進(jìn)行接種。 （ 3）發(fā)酵過程中的條件控制 ① 溫度 發(fā)酵前期，培養(yǎng)溫度應(yīng)稍高些，以有利于菌體的生長(zhǎng)，里氏木霉一般控制前期培養(yǎng)溫度為 30℃ （即最適生長(zhǎng)溫度），大約保持 12h；進(jìn)入產(chǎn)酶期后，應(yīng)適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，里氏木霉產(chǎn)酶期培養(yǎng)溫度一般為 28℃ ，較低的溫度有利于提高酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)酶時(shí)間 [9]。 ② pH 8 里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最適 pH 為 ～ 5。在實(shí)際的發(fā)酵過程中，隨著微生物的代謝活動(dòng)，發(fā)酵 液的 pH 值在不斷變化，要根據(jù)其變化嚴(yán)格控制 pH 值 [1]。 ③ 通風(fēng)量 發(fā)酵早期，菌體剛剛萌發(fā)，數(shù)量較少，呼吸強(qiáng)度較弱，耗氧速度較低，應(yīng)控制通氣量為 1:～ ；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后，菌體代謝旺盛，呼吸強(qiáng)度提高，細(xì)胞大量分裂，細(xì)胞濃度迅速增加，因此耗氧速度較快，應(yīng)控制通氣量為 1:1；產(chǎn)酶時(shí)期，細(xì)胞分裂完全，細(xì)胞濃度最大，形成大量的酶蛋白，也消耗大量的氧氣，應(yīng)控制通氣量為 1:1[1]。 ④ 攪拌 纖維素酶液體深層發(fā)酵中還需要攪拌，以利于熱交換、營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于酶的合成。所以，應(yīng)控制整個(gè)生產(chǎn)過程的攪拌速度為100～ 150rpm。 ⑤ 泡沫控制 發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫，其存在阻礙 CO2 排出，影響溶解氧量。生產(chǎn)上一般采用聚氧丙烯甘油醚或泡敵（聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚）消泡。 ⑥ 產(chǎn)酶量的測(cè)定 發(fā)酵過程中要定時(shí)取樣測(cè)定產(chǎn)酶量，一旦發(fā)現(xiàn)到達(dá)最大酶活產(chǎn)量時(shí)要及時(shí)停止發(fā)酵。 （ 4）發(fā)酵終點(diǎn)的判斷 一般利用里氏木霉進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵的周期為 70h 左右。當(dāng)發(fā)酵液的 pH 上 升 至 5 左右，鏡檢觀察到菌絲自溶、斷裂， 80%以上的菌絲染色著色淺或染不上色時(shí) ，可以放罐 [6]。一般發(fā)酵的產(chǎn)酶率為 %。 （二）纖維素酶的分離與提取 （ 1）發(fā)酵液的預(yù)處理 發(fā)酵結(jié)束后要向冷卻蛇管內(nèi)通入蒸汽，使發(fā)酵液溫度升高至 90℃ 維持 10min，滅活菌體并有利于后續(xù)的過濾過程。加熱結(jié)束后將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵液儲(chǔ)罐中。同時(shí)準(zhǔn)備使用板框過濾機(jī)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，以 除 去菌體和未發(fā)酵的培養(yǎng)基原料。 （ 2）發(fā)酵液過濾 在里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的過程中，在常壓下濾餅形成后，一般采用加壓至 ～ 來過濾。 濾液儲(chǔ)存于儲(chǔ)罐中，分四批進(jìn)行后續(xù)的提取過程。生產(chǎn)中常采用以壓力泵或壓縮空氣為過濾推動(dòng)力的壓濾機(jī)來進(jìn)行過濾。經(jīng)過濾后濾液中的纖維素酶的收率為95%。 （ 3）濃縮 將板框過濾后的濾液調(diào)到 ， 在 40℃ 、 三效 真空蒸發(fā)儀將濾液濃縮至原體積的 30～ 40%[1]，此過程的酶的收率約為 95%。 （ 4）沉淀與酶泥的重新溶解 在酶制劑的生產(chǎn)過程中，一般采取鹽析法進(jìn)行纖維素酶的分離。首先向濃縮酶液中加，靜置 1小時(shí)后利用板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，棄去沉淀。然后向收集的清 9 液中加入 和度的硫酸銨，再靜置 1小時(shí)后過濾棄去清液，得到纖維素酶的粗品。對(duì)于應(yīng)用于 飼料 工業(yè)中的 酶制劑，由于硫酸銨沉淀法析出的酶沉淀，含有大量的無機(jī)鹽，不適合用于食品行業(yè)。因此在其生產(chǎn)過程中，應(yīng)該采用有機(jī)溶劑法進(jìn)行纖維素酶的分離。常用纖維素酶沉淀分離的有機(jī)溶劑為乙醇。乙醇的最適濃度為 70%。提取酶制劑過程中容易引起酶的變性失活，所以必須在 4℃ 左右的低溫下進(jìn)行操作，沉淀析出后要立即分離。有機(jī)溶劑用量一般為酶液體積的 2倍左右，而且，要將酶液的 pH值調(diào)至纖維素酶的等電點(diǎn)附近 ，再用 ～ 。沉淀過程的酶的收率為94%，過濾過程的收率為 95%[1]。 （ 5）纖維素酶的純化 單寧是纖維素酶的天然抑制劑，用單寧結(jié)合活化的瓊脂糖做成親和層析柱，用蒸餾水平衡，再將上一步得到的酶液過柱，使單寧專一性結(jié)合纖維素酶，蒸餾水平衡后，用 ～，就可得到純化的液態(tài)纖維素酶 [1]。酶的親和層析一般控制在較低的溫度下進(jìn)行，以防止由于溫度的升高而使酶在純化過程中變性失活。經(jīng)過該過程后酶的損失率為 7%。 （ 6）洗脫液的濃縮 由于里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶在 60℃ 以上活性迅速下降，所以在真空蒸發(fā)濃縮時(shí)，應(yīng)控制濃縮系統(tǒng)的真空度 ， 使蒸發(fā)溫度在 60℃ 以下。在纖維素酶的生產(chǎn)中一般采用真空蒸發(fā)器，在 50℃ 進(jìn)行真空濃縮，除去約 2/3 的水分。濃縮后的收率為 90%。 （三）酶的成品與包裝 [10] （ 1）液體酶的混合與包裝 向經(jīng)濃縮后的液體酶加入 1,2丙二醇，以維持酶制劑的活性。最終產(chǎn)品的顏色為棕色，密度為 ~，粘度為 50 Pas，裝于有環(huán)氧樹脂涂覆的容量為 200kg的鐵桶中以及容量為 25g 的手提桶中。 （ 2）固體酶的造粒與包裝 將濃縮后的酶液用噴霧干燥法 干燥，形成粉狀的酶。 固體 酶制劑的包裝外要刷明標(biāo)記，包括成品名稱、生產(chǎn)廠家名稱、廠址、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、使用方法、成品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)等。 （四）成品的儲(chǔ)存 包裝后的成品經(jīng)過水平皮帶輸送機(jī)運(yùn)到成品庫中，再由叉車搬運(yùn)到存放的位置。成品庫要求低溫干燥通風(fēng)，庫內(nèi)溫度在 0~25℃ 范圍內(nèi)，保質(zhì)期為半年 。 避免在 30℃ 以上長(zhǎng)期儲(chǔ)存，避免日光暴曬和雨淋。 （五）成品質(zhì)量檢測(cè) [11] 酶制劑的成品各項(xiàng)指標(biāo)要符合《工業(yè)酶制劑通用檢測(cè)規(guī)定和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存》QB/T 180493 的要求。并按照下述的測(cè)定纖維素酶活力的方法測(cè)定其 CMC 酶、 FPA（濾紙?zhí)牵┟负?BG 酶活性，并用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法來測(cè)定該酶制劑的純度與分子量。 I． CMC 酶活的測(cè)定 5%CMC 溶液（ 、 ， ） ， 適當(dāng)稀釋 10 后的酶液 ， 40℃ 恒溫水浴 60min，用 3,5二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖； II． FPA 酶活的測(cè)定 取適當(dāng)稀釋后的酶液 ， 再加入 磷酸緩沖液（ ）和 濾紙條 1張，其余同 CMC 測(cè)定。 III． BG（ β1,3葡萄糖苷酶）酶活的測(cè)定 取適當(dāng) 稀釋酶液 ，加入 %水楊 酸 溶液（溶于 、 緩沖液）， 50℃ 反應(yīng) 30min， 加入 3mLDNS 試劑測(cè)糖。 里氏木霉 的發(fā)酵時(shí)間為 70h 左右，考慮到裝料、實(shí)消、放料、清洗需要一部分時(shí)間，因此確定整個(gè)發(fā)酵周期為 4d，在 330d 的工作日內(nèi)，共有 82 個(gè)生產(chǎn)周期。 由設(shè)備計(jì)算（ ）可得，生產(chǎn)中共需要 23 m3 的發(fā)酵罐 80 個(gè)。發(fā)酵罐的裝料 系數(shù)為 70%，發(fā)酵產(chǎn)率為 %，提取率為 70%，種子罐的裝料系數(shù)為 75%， 發(fā)酵液密度 約為 1020 kg/m3。 主要技術(shù)參數(shù)：發(fā)酵時(shí)間： 70h 生產(chǎn)周期： 4d 生產(chǎn)天數(shù)： 328d 年產(chǎn)量： 5000t 預(yù)設(shè)發(fā)酵罐個(gè)數(shù)： 80 個(gè) 發(fā)酵罐裝料系數(shù)： 70% 發(fā)酵產(chǎn)率： % 酶提取率： 70% FPA 酶活： 4626～ 4781 單位 / g （ 1）玉米秸稈 玉米秸稈需經(jīng)過粉碎后才能用于發(fā)酵。在粉碎過程中隨著運(yùn)輸、粉塵等會(huì)有原料損失，按 10%的損失率及 3t/t(原酶 )的投料比計(jì)算，可得 每次發(fā)酵周期需要的原料玉米秸稈量為： m1 = 發(fā)酵液總質(zhì)量 產(chǎn)酶率 玉米秸稈投料比 247。（ 1﹣ 損失率） = [802370%﹢ 4375%]1020%3247。（ 1﹣ 10%） = 年用量 : M1 =82 = （ 2）麥麩 碳源中玉米秸稈與麥麩的比例為 4:1 時(shí)纖維素酶的產(chǎn)量最高。由此麥麩的用量為： m2 = 玉米秸稈投料量 247。4 = 247。4 = 年用量 : M2 = 82 = 11 （ 3）酵母膏 一個(gè)發(fā)酵 周期中的培養(yǎng)基的總質(zhì)量為： [802370%﹢ 4375%]1020 = 酵母膏的用量為 %，則一個(gè)發(fā)酵周期中酵母膏的用量為： m3 = % = 年用量 ： M3 = 82 = （ 4）木質(zhì)纖維 木質(zhì)纖維在種子培養(yǎng)基中充當(dāng)碳源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑。其用量為 1%。 一個(gè)發(fā)酵周期中木質(zhì)纖維的用量為： m4 =1% = 年用量 ： M4 = 82 = （ 5）蛋白胨 蛋白胨在培養(yǎng)基中的用量為 %，一個(gè)發(fā)酵周期中蛋白胨的用量為： m5 = % = 年用量 ： M5 = 82 = （ 6） MgSO47H2O MgSO47H2O 的用量為 %，一個(gè)發(fā)酵周期中 MgSO47H2O 的用量為： m6 = % = 年用量 ： M6 =82 = （ 7） KH2 PO4 KH2 PO4 的用量為 %，一個(gè)發(fā)酵周期中 KH2PO4 的用量為： m7 = % = 12 年用量 ： M7 = 82 = （ 8） CaCl22H2O CaCl22H2O 的用量為 % ，一個(gè)發(fā)酵周期中 CaCl22H2O 的用量為： m8 =% = 年用量 ： M8 = 82 = （ 9） Tween80 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加量為 %（ 體積比 ）， 種子培養(yǎng)基中添加量為 %。一個(gè)發(fā)酵周期中的使用 量為 m9 =802370%%﹢ 4375%% = m3 年用量 ： M9 = 82 = m3 （ 1）硫酸銨 在整個(gè)生產(chǎn)工藝中硫酸銨有兩種用途：一種是作為氮源；另一用途是在纖維素酶的沉淀粗提中作為沉淀劑。作為氮源的添加量為 %，作為沉淀劑的用量為 20%的飽和度和60%的飽和度。由此進(jìn)行計(jì)算： ① 氮源用量： (NH4) 2 SO4 在發(fā)酵培養(yǎng)基中的用量為 % ，在種子培養(yǎng)基中的 用量為 %。一個(gè)發(fā)酵周期中 (NH4) 2 SO4 的用量為： m10 = 802370%1020%﹢ 4375%1020% = 年用量 ： M10 =82 = ② 沉淀劑用量： 在 燃料乙醇 工業(yè)用酶制劑的生產(chǎn)過程中使用的沉淀劑為硫酸銨，一個(gè)發(fā)酵周期中共有8 個(gè)發(fā)酵罐用于該酶的生產(chǎn)。在提取過程中，發(fā)酵液經(jīng)過過濾后會(huì)有部分體積損失，且過濾后的濾液經(jīng)過真空濃縮。因此可估計(jì)過濾后的濾液體積為 2370%4080%40%= 。 13 在用鹽析法分離纖維素酶的過程中，處理液的 (NH4) 2 SO4 初始飽和度為 0，欲達(dá)到 20%的飽和度，在 25℃ 條件下，需向 1m3 溶液中加入 114kg 的 (NH4) 2 SO4(查 63 頁表 41)。 經(jīng)靜置、過濾處理后，再向?yàn)V液中加入 (NH4)