植物組織培養(yǎng)-文庫吧
2025-01-06 04:56 本頁面
【正文】 無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生 ，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與 冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率 有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。 1. 主要儀器設(shè)備 (1) 用于組織和細胞培養(yǎng)的全套設(shè)備； (2) 普通電冰箱； (3)70 ℃ 80℃ 的低溫冰箱； (4) 程序降溫器； 四、超低溫保存的基本設(shè)備和程序 (5) 玻璃或塑料試管（ 5ml 或 10 m1），封蓋嚴(yán)密，不進液氮； (6) 液氮 。 (7) 光學(xué)顯微鏡和紫外熒光顯微鏡； (8) 分光光度計。 2 . 基本程序 (1) 材料的準(zhǔn)備與選擇。 (2) 預(yù)處理。 (3) 將材料裝入試管，并隨即插入冰浴中。 (4) 加入 0℃ 預(yù)冷的冰保護劑，在 0℃ (冰浴中 )放置30一 45分鐘。 (5) 降溫冰凍。 (6) 保存后的化凍：一般在 37— 40 ℃ 溫水浴中快速化凍。 (7) 活力測定 , 通常采用 TTC法 (氯化三苯四氮唑還原法 )。如果是單細胞或原生質(zhì)體，可采用活性熒光素染色法，顯示活細胞，統(tǒng)計存活率。 (8) 再培養(yǎng)，觀察組織細胞恢復(fù)生長的速度、存活率、植株的再生能力。 (9) 遺傳性狀的分析：如植株的形態(tài)特征、生長發(fā)育狀況、染色體、同工酶及抗逆性等。 1．材料的特性； 基因型、抗凍性、器官組織和細胞年齡、生理狀態(tài)。 2．預(yù)處理 目的： A. 增加細胞分裂和同步化； B. 減少細胞內(nèi)自由水的含量； C. 增強細胞的抗寒性。 五、影響超低溫保存效果的主要因素 預(yù)處理方法： (1)細胞、組織繼代培養(yǎng)中．細胞分裂分化同步化的調(diào)控，增加指數(shù)生長期細胞。 (2)預(yù)培養(yǎng)，增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透壓；或在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護劑，如脫落酸 (ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亞砜 (DMSO)等。 (3)低溫鍛煉：如香石竹莖尖經(jīng) 4℃ 低溫預(yù)處理14天，不僅提高了存活率．而且分化率從 30％增加到 60％。 3．冰凍保護劑 迄今，已經(jīng)報道了多種類型的冰凍保護劑。常用的是二甲基亞砜 (DMSO)、甘油、糖和糖醇類物質(zhì)、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。 但作為冰凍保護劑的物質(zhì)應(yīng)該具備以下特性： （ 1）易溶于水； （ 2）在適當(dāng)濃度下對細胞無毒； （ 3） 化凍后容易從組織細胞中去除。 冷凍保護劑的作用： (1) 降低冰點，促進過冷卻和“玻璃態(tài)化”的形成； (2) 提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長， (3) DMSO可使膜物質(zhì)分子重新分布，增加細胞膜的透性，在溫度降低時，加速細胞內(nèi)的水流到細胞外結(jié)冰，防止細胞內(nèi)結(jié)冰的傷害； (4) 穩(wěn)定細胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)，特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷害，非透性保護劑的主要作用在質(zhì)膜上。 4．降溫冰凍方法 (1) 快速冰凍法：將材料從 0℃ ，或者其他預(yù)處理溫度 (如木本植物的冬芽在 3℃ 一 10℃ 預(yù)處理 20天 )直接投入液氮。其降溫速度在每分鐘 l000℃ 以上。 植物體內(nèi)的水分在降溫冰凍過程中， 從 10℃ 到 140℃ 是冰晶形成和增長的危險溫度區(qū)， 在 140℃ 以下，冰晶不再增生。因此，快速冰凍法成功的關(guān)鍵在于，利用超速冷凍，使細胞內(nèi)的水分迅速通過冰晶生長的危險溫度區(qū)，即細胞內(nèi)的水分還未來得及形成冰晶中心，就降到了 196℃ 的安全溫度，從而避免了細胞內(nèi)結(jié)冰的危險。
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