第8章-標(biāo)記-文庫(kù)吧
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【正文】 22/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss17 三、核素標(biāo)記 ? （一）核酸探針傳統(tǒng)的標(biāo)記物是用放射性同位素，多用 32P dNTP、 3H dNTP 、 35S dNTP等。用放射性同位素標(biāo)記核酸有以下優(yōu)點(diǎn)： ? ? ? 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss18 （二）放射性同位素標(biāo)記技術(shù)也存在以下缺點(diǎn)： ? ，必須經(jīng)常標(biāo)記探針 ? ? ? 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss19 32P使用安全。 35S的前體標(biāo)記物 NTP或 dNTP是借助以取代與磷酸共價(jià)相連的氧原子制成的。 和降解分析，與 32P、 35S、 125I等比較，它的能量最低。 （三）幾種常用放射性同位素比較 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss20 常用放射性核素的物理性質(zhì) 核素 半衰期 100%純度時(shí)核素放射性活性 (Specific activity) (Ci/mmol) 放射粒子的最大能量 Emax(KeV) ? ? 3H 29 － 14C 5100年 62 156 － 32P 9120 1710 － 35S 1490 169 － 125I 60天 2400 131I 16100 608 365 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss21 NTP或 dNTP的 ?磷酸位上。 用放射自顯影或磷酸圖像儀檢測(cè)。 Nucleotide labeling 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss22 ? 32P or 33P 可取代 dNTP或 NTP不同磷酸位上的 P原子 ， 35S可取代核酸中磷酸分子上的一個(gè) O原子， 3H取代 H原子。 N N O NH 2 H H O H O O CH 2 H H H H 5?4?3? 2?1?H O O O P ??dCMP 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss23 N N O NH 2 H H O H O O CH 2 H H H H 5?4?3? 2?1?H P dCMP N N O NH 2 H H O H O O CH 2 H H H H 5?4?3? 2?1?H S dCMP N N O NH 2 H H O H O O CH 2 H H H H 5?4?3? 2?1?H H O O O P ??O O O P ??O O O P ??2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss24 四、常用的探針標(biāo)記法 DNA探針標(biāo)記 （ 1）隨機(jī)引物介導(dǎo)法 （ 2）切口平移法 DNA探針制備 DNA探針 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss25 DNA探針標(biāo)記 （ 1）隨機(jī)引物介導(dǎo)法 ? 隨機(jī)引物是 6～ 12個(gè)核苷酸單鏈（來(lái)源于某種生物組織細(xì)胞的 DNA降解小片段或人工合成的）。 ? 隨機(jī)引物與線性 DNA模板雜交，在 DNA聚合酶的催化下，從引物的 3′ 末端開(kāi)始按 5′→3′ 方向合成與模板 DNA互補(bǔ)的 DNA鏈，如有 [α 32P]dNTP或其他標(biāo)記物的摻入，就可產(chǎn)生標(biāo)記的 DNA探針。 見(jiàn) P182圖 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss26 ① 變性 DNA ② 加入隨機(jī)引物混合物 (六核苷酸 )和dNTP標(biāo)記混合物 ③ 加入 Klenow 片斷 (無(wú)核酸外切酶活性 ) 2022/8/27 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss27 Labelling probes by “random priming” DNA 片斷 熱變性 5’ 5’ 3’ 3’ 加入隨機(jī)引物
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