國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)標(biāo)書(shū)的書(shū)寫(xiě)-文庫(kù)吧
2025-07-31 21:14 本頁(yè)面
【正文】 詳細(xì)論述和分析這些問(wèn)題產(chǎn)生 的原因，以及研究的難點(diǎn)、焦點(diǎn)， 從而為本次申請(qǐng)項(xiàng) 目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。 D、對(duì)擬采用的技術(shù)方法進(jìn)行介紹和分析。 成熟的方法 重點(diǎn)介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí) 驗(yàn)依據(jù)。 新方法在詳細(xì)介紹其原理的基礎(chǔ)上 ，闡明可以應(yīng)用于本 研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 絕不能簡(jiǎn)單的移植： 必須對(duì)所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、 流程尤其是在實(shí)際運(yùn)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題要十分清楚 。 例如： 抗體 + 功能基團(tuán) ，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合， 但存在“ 活性、表達(dá)載體選擇、純化 等問(wèn)題。 E、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。 防治白內(nèi)障必須針對(duì)其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。 就致病的環(huán)境因素講， 氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周?chē)h(huán)境中離子濃度改變及一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。 就研究的部位分， 晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的 晶狀體上皮細(xì)胞 在白內(nèi)障的形成中的變化 更引人關(guān)注 。 因?yàn)?晶狀體上皮細(xì)胞 是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞 ，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此， 晶狀體上皮細(xì)胞 還是晶狀體中 受外來(lái)刺激影響 較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的 晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、 細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變， 與單純老化的晶狀體之間存在差異 [35] 。 體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí) 多種因素 (H2O UVB、晶狀體蛋白的自身抗體 )誘發(fā)的白內(nèi)障模型中 晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié) [68]。 因此， 從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié) 。其中晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制是問(wèn)題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問(wèn)題。 白內(nèi)障的形成 與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化 是多種因素相互作用的結(jié)果 ， 包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性 多種基因表達(dá)的改變。 目前， 國(guó)內(nèi)外對(duì)白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面： 一是體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究 UVB輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞 ， 其 NaKATP酶的活性增加 ， 蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加 ， 其中 cfos基因的表達(dá)增加 ；還有 組蛋白 H H3的低表達(dá) `和蛋白酶 C、 β肌動(dòng)蛋白 、 γ肌動(dòng)蛋白 基因的高表達(dá) [912]。 Carper等 [13]利用 RTPCRDD 技術(shù)研究 H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示 NADH脫氫酶 4亞基 、 細(xì)胞色素 b、 谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少 及細(xì)胞因子的核蛋白 、 替代拼接因子 β三羥基異丁酰輔酶 A水解酶 基因表達(dá)增加 。 二是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。 波形纖維蛋白基因、雜交的 Ⅲ 型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢(shì)。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制 [14,15]。 Gong等 [16]報(bào)告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白 α3基因敲除小鼠（ knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。 雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。 三是對(duì)人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究 。 Lee[17]利用 RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白 、 I型膠原纖維 、 α平滑肌蛋白 、 TGFβ TGFβ TGFβⅡ 型受體 、 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的 基因表達(dá)有差異 。 Kantorow等 [18]利用 RTPCRDD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障 有三個(gè)高表達(dá)基因和 12個(gè)低表達(dá)的基因 。 但就 DDPCR技術(shù)來(lái)講 ， 在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性 、假陽(yáng)性以及克隆全長(zhǎng) cDNA的問(wèn)題 。 上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果 ，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 尋找 白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間 差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。 尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù) 它是 …… ， 但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜 。 經(jīng)過(guò)改進(jìn)后的抑制性消減雜交 是 Diatchenko等 1996年建立的方法 ） …… 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作 ，但仍然問(wèn)題很多 。 改良消減雜交技術(shù) [19， 20] 是我校生化教研室 建立了的 ， 其特點(diǎn)是：簡(jiǎn)便易行 ， 能夠獲得 目
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