8抗體技術(shù)-文庫吧
2025-07-20 08:53 本頁面
【正文】 髓瘤細(xì)胞混合，在 PEG作用下融合，然后用培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋 ,將混合體系移入選擇性培養(yǎng)基 HAT中培養(yǎng)。 HAT選擇性培養(yǎng)的原理 ? 融合后產(chǎn)生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合細(xì)胞和未融合的骨髓瘤細(xì)胞。 ? 次黃嘌呤（ H ）、氨基碟呤（ A ）和胸腺嘧啶（ T ） ? 氨基碟呤（ A ）阻斷嘌呤和嘧啶的合成 HAT選擇性培養(yǎng)的原理 ? 骨髓瘤細(xì)胞選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HGPRT）缺陷型 ,不能利用外源性次黃嘌呤來合成自身核酸中所需要的嘌呤，而內(nèi)源性嘌呤和嘧啶的合成又被氨基碟呤所阻斷，不能在 HAT培養(yǎng)基上生長。 ? B淋巴細(xì)胞無法在體外繁殖傳代。 ? 脾細(xì)胞內(nèi)有這種轉(zhuǎn)移酶，故脾瘤雜交細(xì)胞能用 H和 T合成 DNA而得以生長。 ? 在最適培養(yǎng)條件下，大約 105個脾細(xì)胞才能形成一個雜交瘤細(xì)胞，單個或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常加入飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞） ? 飼養(yǎng)細(xì)胞釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。 ? 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，應(yīng)用較多。 篩選陽性克隆與克隆化 ? 抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的 5%左右，所以融合后 89天對每孔的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體活性的篩選工作，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。 ? 常用方法： 酶聯(lián)免疫吸附法 ，免疫熒光技術(shù)（適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測）和放射免疫技術(shù)。 ? 盡早克隆化。 雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? 對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析 ? 對雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行 Ig類和亞類的鑒定 ? 對單克隆抗體特異性、純度和識別抗原的相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。 單克隆抗體的大量制備 ? 體外培養(yǎng)法 – 在培養(yǎng)液中添加 10%20%小牛血清，由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá) 100mg/ml,純化困難。小牛血清又是支原體污染的原因。 – 無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。但產(chǎn)量不高。 – 用懸浮培養(yǎng)方式代替靜止培養(yǎng)法，微載體懸浮培養(yǎng) ? 多采用 動物體內(nèi)誘生法 – 雜交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞都來自 BALB/c小鼠，故選用 BALB/c小鼠制備單克隆抗體。 – 先給小鼠注射刺激性的有機(jī)溶劑降植烷（破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細(xì)胞易于增殖的環(huán)境），然后注射雜交瘤細(xì)胞，待生成腹水后再抽取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。 – 操作簡便，經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價高，可有效保存雜交瘤細(xì)胞株。缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 單克隆抗體的純化 ? 在純化之前必須明確其 Ig類和亞類， Ig類和亞類不同，純化方法也不同； ? 根據(jù)用途不同選擇不同的純化方法； ? 如用于體外診斷試劑的 IgG類抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合親和層析親和層析的方法。 IgM類抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合凝膠過濾的方法； ? 體內(nèi)診斷試劑或治療用藥物應(yīng)去除內(nèi)毒素、病毒、核酸等微量污染物，必須采用親和層析和陰離子交換層析。 ? 動物體內(nèi)誘生法制備的單克隆抗體的純化方法： 1 澄清和沉淀處理 2 分離 凝膠過濾 陰離子交換層析 親和層析 ２、單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 A、用作診斷試劑 1. 檢測淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化 階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。 2. 鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。 3. 用于腫瘤的診斷和分型 4. 激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判 斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài) B、用作研究工具 1. 純化抗原 2. 分析和探查抗原結(jié)構(gòu) 3. 分析抗原決定簇分子的功能 C、用于疾病的治療 1. 抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治 2. 抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療 3. 抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療 單克隆抗體用于免疫治療存在的問題 1) 單克隆抗體的特異性 由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常
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