【正文】 常選用一些代謝微弱的糖來充當(dāng)，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，這些糖基本上不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，而只存留在培養(yǎng)基中，起到調(diào)節(jié)滲透的作用。3．抗生素：培養(yǎng)的植物組織內(nèi)部攜帶有病原物，表面消毒不解決問題時(shí)，可在配置培養(yǎng)基時(shí)添加抗生素，如加200～300U的慶大霉素可使細(xì)菌污染受到很好的控制。 二、培養(yǎng)基的選擇 1．選擇合適的培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合于許多單子葉植物， White培養(yǎng)基適于根的培養(yǎng) 激素濃度和相對(duì)比例的確定 先參考已有的報(bào)道，看是否有用相同植物、相同組織或相近者做過成功或失敗的試驗(yàn)，如果有則直接作為參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇3～5個(gè)水平，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。 三、培養(yǎng)基的配制 （一）、配制母液（二）、配制培養(yǎng)基 (三)、配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的有關(guān)問題 高溫滅菌的基本過程 檢查滅菌鍋內(nèi)有無足夠量的水，最好用蒸餾水或去離子水，因?yàn)樽詠硭休^多的礦物質(zhì)，容易使鍋內(nèi)形成水垢，影響鍋的使用壽命。將需要滅菌的器皿、培養(yǎng)基等放入鍋內(nèi)，不要裝得太滿，以不超過鍋的容量3／4為宜。 高溫下培養(yǎng)基成分的降解 經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10％。NAA、2，4一D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D葡萄糖和D果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長(zhǎng)的物質(zhì)。高溫可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，則維生素B1會(huì)被迅速降解。 第六章 無菌操作技術(shù)與設(shè)備一、干熱滅菌 干熱滅菌就是在180℃的烘箱內(nèi)對(duì)器皿進(jìn)行殺菌處理，是一種徹底殺死微生物的方法。適合于干熱滅菌的器皿和物品有：①玻璃器皿，如三角瓶、燒杯、量筒等；②金屬物品，如鑷子、解剖刀、剪刀等；③可以高溫滅菌的塑料制品。二、濕熱滅菌濕熱滅菌就是人們平時(shí)所說的蒸汽滅菌。滅菌的溫度為121℃， kPa，滅菌時(shí)間除液體外要求在121℃下維持15 min以上。液體滅菌時(shí)間可依據(jù)體積而定，體積越大，需要時(shí)間越長(zhǎng)，10L需28min，25L需31min。 濕熱滅菌時(shí)應(yīng)注意以下問題：不能隨意延長(zhǎng)滅菌時(shí)間，因?yàn)檠娱L(zhǎng)時(shí)間會(huì)使一些化合物過多分解，特別是蔗糖會(huì)分解為單糖，使培養(yǎng)基pH降低，瓊脂不能很好的凝固；如果滅菌鍋沒有吹干程序，從鍋內(nèi)取出的紙制品、紗布等最好立即轉(zhuǎn)到60℃的溫箱中吹干；由于錫箔紙不透氣，推薦使用牛皮紙或報(bào)紙等包裝物品，以利于水分快速蒸發(fā)；滅菌鍋所裝蒸餾水或去離子水應(yīng)經(jīng)常更換，以防止微生物污染和水中雜質(zhì)過多，給滅菌鍋和要滅菌的物品帶來不利影響； 三、微過濾滅菌是使需要滅菌的液體通過一個(gè)微孔濾膜，以除去液體中的微生物、微顆粒等，～lO181。m。這種方法對(duì)于高溫滅菌容易引起分解的物質(zhì)最為適宜，如容易分解的維生素、激素、植物組織提取物、抗生素等。微過濾滅菌的關(guān)鍵部分是微孔濾膜，如要徹底清除細(xì)菌、酵母等微生物。如要獲得原生質(zhì)體。 四、化學(xué)藥物滅菌 鑷子、解剖刀等器具的滅菌：將準(zhǔn)備使用的鑷子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精浸泡。使用時(shí)取出鑷子或解剖刀，放在酒精燈上加熱至酒精完全除去為止，用完后再放回75%酒精中。外植體的滅菌：將植物材料先用自來水加洗潔精少許浸泡10min以上，浸泡期間要輕輕攪動(dòng)幾次，以便使植物材料與溶液充分接觸，然后用自來水沖洗10 min左右。在超凈工作臺(tái)上，將材料在70％酒精中進(jìn)行表面預(yù)消毒30秒，倒掉酒精，％升汞(HgCl2)進(jìn)行消毒8分鐘左右，或用1％次氯酸鈉(NaOCl)或次氯酸鈣Ca(OCl)2消毒20 min左右，具體時(shí)間要根據(jù)材料而定。然后用無菌水沖洗3～4次，每次2 min左右。，；通常往消毒液中添加幾滴吐溫20或吐溫80等表面活性劑，以提高滅菌效果。 五、抗生素滅菌 首先必須弄清楚要?dú)⑺赖氖钦婢⒓?xì)菌還是病毒，是哪類真菌、哪類細(xì)菌或病毒；其次應(yīng)知道使用的抗生素是否對(duì)培養(yǎng)的植物組織有不良影響；最后要確定抗生素的使用濃度、使用時(shí)期和處理時(shí)間的長(zhǎng)短?？股氐氖褂弥荒苁怯米黝A(yù)防微生物污染的方法，而不能用于殺死微生物，因此在使用時(shí)最好加在培養(yǎng)基當(dāng)中，而不宜作為一種殺菌劑單獨(dú)使用。因?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為植物基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要方法，在轉(zhuǎn)基因過程中的除菌和抑菌都離不開抗生素，所以使用抗生素已逐漸成為植物組織培養(yǎng)中的滅菌技術(shù)之一。六、無菌操作中其他應(yīng)注意的問題 注意防止紫外線的危害 植物組織培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)上的紫外燈開放時(shí)間不可太長(zhǎng)，最好在30min之內(nèi)。超凈工作臺(tái)上的紫外燈關(guān)閉以后不要立即走近工作臺(tái)，最好讓無菌風(fēng)吹2～3 min后再開始操作。 第七章 離體快速繁殖方法微繁——在無菌條件下進(jìn)行植物的無性繁殖。1960年，Morel提出了一個(gè)離體無性繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。使微繁技術(shù)真正實(shí)用化。 一、無菌培養(yǎng)物的建立 外植體的選擇：莖段、莖尖、葉片、嫩芽、鱗莖的鱗片、花器官等。 注意：（1）、在生長(zhǎng)季節(jié)開始時(shí)由活躍生長(zhǎng)的枝條上切取的外植體，通常能產(chǎn)生最好的效果。（2）、對(duì)于需要低溫、高溫或特殊的光周期才能打破休眠的鱗莖、球莖、塊莖和其他器官，應(yīng)當(dāng)在取芽之前進(jìn)行必要的處理。消毒二、莖芽的增殖（一）莖芽增殖的類型器官型(organ type) 以芽增殖芽的方法，其遺傳性狀穩(wěn)定，成為目前快速繁殖中采用的主要方法。器官發(fā)生型(organogenesis type) 外植體先脫分化形成愈傷組織，再分化出器官的方式。胚狀體發(fā)生型(embryoid type) 體細(xì)胞增殖發(fā)育的順序與受精卵發(fā)育極為相似，經(jīng)過原胚一球形胚一心形胚一魚雷胚一子葉胚5個(gè)時(shí)期，最后發(fā)育成完整的植株。胚狀體可從愈傷組織形成，也可不經(jīng)過脫分化直接從子葉、下胚軸和花藥培養(yǎng)形成。通過胚狀體的培養(yǎng)可以獲得大量的植株，大大提高繁殖率原球莖型(protoeomb type) 目前蘭花的快速繁殖主要靠原球莖的分化方式。 球莖芽型(globose stem bud type) 觀葉海棠的葉柄表面可產(chǎn)生一個(gè)個(gè)圓球形的小突起（球形莖），小突起的一端產(chǎn)生芽和葉片，另一端長(zhǎng)出根，最后形成完整的小植株。 6 塊莖型(tuber type) 花葉芋的葉片或葉柄上，先形成類似愈傷組織的小硬粒突起，并逐漸形成粒狀的芋塊。隨后粒狀芋塊上分化出新的1～4個(gè)小突起。由小突起上分化出芽原基。隨著小芋塊的增大，分化出的芽也越密集并形成許多小苗，在小苗基部與芋塊交界處分化出白色的根。 7 鱗莖型(bulb type) 百合的鱗莖切塊基部近軸面或在邊緣直接形成帶根的小鱗莖。如卷丹鱗片的頂部、中部和基部均能誘導(dǎo)分化出小鱗莖。郁金香鱗莖旁又會(huì)分化出小鱗莖。（二）器官發(fā)生型 1 愈傷組織形成的條件 誘導(dǎo)愈傷組織常用的生長(zhǎng)素是2，4一D，IAA和NAA，常用的細(xì)胞分裂素是KT和6BA。在禾谷類植物中，只用2，4一D就能成功地誘導(dǎo)愈傷組織。多數(shù)情況下誘導(dǎo)愈傷組織既需要生長(zhǎng)素，也需要細(xì)胞分裂素。黑暗條件下有利于愈傷組織的形成，光照對(duì)組織的愈傷化有抑制作用。 2 愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控 優(yōu)良愈傷組織須具備的特性： (1)高度的胚性或再分化能力，以便得到再生植株；（2）容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系；（3）旺盛的自我增殖能力，以便建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。（4）經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保存不喪失胚性，以便對(duì)它們進(jìn)行各種遺傳操作。 愈傷組織狀況調(diào)整的策略 （1）選擇適當(dāng)?shù)幕蛐秃屯庵搀w。如禾谷類植物愈傷組織培養(yǎng)的成功，是由于選擇了未成熟胚和幼穗作為外植體，它們的根和幼葉雖然也能形成愈傷組織，但都是非胚性的。（2）選擇正確的培養(yǎng)基，特別是正確的植物激素種類和濃度，及二者之間正確的配比。 （3）采用某些特殊的理化因素，改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。如在玉米幼胚愈傷組織培養(yǎng)中，通過在培養(yǎng)基中添加5mg／L或10 mg／L AgNO3，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。（4）還原態(tài)氮具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細(xì)胞分裂的作用。增加培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有機(jī)形式的還原態(tài)氮)可明顯促進(jìn)細(xì)胞分裂；增加培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮或減少還原態(tài)氮，可顯著抑制細(xì)胞分裂。 3 影響莖芽分化的因素 化學(xué)因素 （1）細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素 在莖芽誘導(dǎo)中，2ip在通常情況下是最為有效的。（2）生長(zhǎng)素能抑制芽的形成: 在煙草中，濃度低到5μmol／L的IAA即足以完全抑制莖芽的自發(fā)分化。當(dāng)與激動(dòng)素或腺嘌呤結(jié)合使用時(shí)，生長(zhǎng)素可以抵消它們促進(jìn)莖芽形成的作用。（3）赤霉素對(duì)于莖芽的分化有抑制作用:在煙草中，若把正在分化的愈傷組織在黑暗條件下以GA3處理，時(shí)間即使短至30～60min，也會(huì)減少芽的分化，而且在處理之后48h，所有的擬分生組織或莖芽全都不復(fù)存在。 物理因素 （1）瓊脂濃度： 在培養(yǎng)煙草薄層組織時(shí)，當(dāng)瓊脂為l％時(shí)，只能形成花；隨著瓊脂濃度的下降，花的形成頻率減少，營(yíng)養(yǎng)芽的分化出現(xiàn)。在液體培養(yǎng)基中，則只能愈傷化和分化營(yíng)養(yǎng)芽 ；（2）滲透壓： 在由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，～ mol／L甘露醇以使?jié)B透壓保持在200到400毫滲透壓摩爾時(shí)，才可能出現(xiàn)莖芽的分化。 （3）光照： 高強(qiáng)度的光照對(duì)煙草莖芽的形成有抑制作用。天竺葵愈傷組織只有在光照和黑暗周期交替(15～16 h光照最好)條件下才能分化莖芽，培養(yǎng)在連續(xù)光照下的愈傷組織總是白色的，不表現(xiàn)器官發(fā)生。光質(zhì)對(duì)器官分化也有影響。在煙草中藍(lán)光促進(jìn)莖芽分化，紅光刺激生根。 （4）溫度： Skoog(1944)在5～33℃的范圍內(nèi)研究了溫度對(duì)煙草愈傷組織生長(zhǎng)和分化的影響，發(fā)現(xiàn)直到33℃時(shí)愈傷組織的生長(zhǎng)都隨溫度的上升而增加，但只有在18℃時(shí)最適合莖芽的分化，在33℃時(shí)不能形成莖芽。 其他因子：培養(yǎng)材料的染色體組，供體植株和外植體的生理狀態(tài)，外植體的細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)，培養(yǎng)物的歷史以及內(nèi)生激素水平。 （三）影響莖芽增殖的因素?zé)o機(jī)鹽水平 對(duì)有些植物來說，MS培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽水平或有毒或太高。如烏飯樹的莖芽在只含1／4強(qiáng)度MS無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中能長(zhǎng)得很好，無機(jī)鹽水平再高或是有毒或是并沒什么好效果。激素 CTK 為了獲得健壯的莖芽應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度。細(xì)胞分裂素使用的 ～5 mg／L，大多數(shù)適當(dāng)?shù)臐舛仁?～ 2 mg／L。GA 為促使莖的伸長(zhǎng)，有時(shí)加入GA； 生長(zhǎng)素 在進(jìn)行莖芽繁殖時(shí)，IAA、～1mg／L。瓊脂 %～％的瓊脂固化。但在卡特蘭和大多數(shù)鳳梨科植物中，只有在液體培養(yǎng)基中才能把培養(yǎng)建立起來。應(yīng)用液體振蕩培養(yǎng)的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是莖芽一邊增殖一邊彼此離散，不必用人工把成簇的莖芽切開。光照和溫度光的作用只是滿足某些形態(tài)發(fā)生過程的需要，因此1000～5000 lx的光強(qiáng)即已足夠。光周期嚴(yán)格地說也是不重要的。每天16 h光照／8 h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人滿意的效果。培養(yǎng)室的溫度一般恒定在25℃左右。 三、離體枝條的生根 試管內(nèi)生根 1）生根培養(yǎng)基應(yīng)降低鹽的濃度，減少到1／2MS或1／4MS。 2）誘導(dǎo)生根需要有適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素，最常用的是NAA和IBA，～ mg／L。3）對(duì)于難生根的植物，可嘗試把它們的下端浸在高濃度生長(zhǎng)素溶液中若干時(shí)間(由幾秒到幾小時(shí))之后，再插于無激素培養(yǎng)基中。4）在生根培養(yǎng)基中減少蔗糖濃度(如減到1％)和增加光照強(qiáng)度，能刺激小植株通過光合作用制造食物的能力，以便由異養(yǎng)型過渡到自養(yǎng)型。5）枝條在離體條件下生根所需的時(shí)間由10d到15d不等。根長(zhǎng)15mm左右時(shí)移栽最為方便，更長(zhǎng)的根在移栽時(shí)易斷，會(huì)降低植株的成活率。 試管外生根 在有些植物中，可以把在離體條件下形成的枝條當(dāng)做微插條處理，使它們?cè)谕林猩Ｔ谶@種情況下，須把插條的基部切口先用標(biāo)準(zhǔn)的生根粉或混在滑石粉中的IBA處理；有些植物如月季，則可先在試管內(nèi)誘導(dǎo)枝條形成根原基，然后再移栽土中，遮蔭保濕，待其生根。試管外生根由于減少了一個(gè)無菌操作步驟，因而可降低成本。 無根苗的嫁接 試管內(nèi)嫁接(微體嫁接): ～ ，以在試管內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)出來的帶根無菌苗為砧木，在無菌條件下借助顯微鏡進(jìn)行嫁接，之后繼續(xù)在試管內(nèi)培養(yǎng)，愈合后成為完整植株再移入土中。 試管外嫁接: 無籽西瓜試管苗嫁接到瓠子上后，在溫度為25～30℃，相對(duì)濕度基本飽和的條件下，3d后傷口長(zhǎng)出愈傷組織，1周后成活并長(zhǎng)出新葉。 四、壯苗、煉苗和移栽 需壯苗、煉苗的原因 ：試管苗生長(zhǎng)在恒溫、高濕、弱光、無菌和有完全營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的條件下，雖有葉綠素，但營(yíng)異養(yǎng)生活，在形態(tài)解剖和生理特性上都有很大脆弱性，如無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關(guān)閉功能等。這樣的試管苗若未經(jīng)充分鍛煉，一旦被移出試管，投入到一個(gè)變溫、低濕、強(qiáng)光、有菌和缺少完全營(yíng)養(yǎng)的條件下，必定要被劇變的環(huán)境所吞噬。 壯苗： 是移栽成活的首要條件，在培養(yǎng)基中加入一定數(shù)量的生長(zhǎng)延緩劑如多效唑(PP333)，B9或矮壯素(CCC)等，在很多種植物中都是培育壯苗的一項(xiàng)有效措施。煉苗： 壯苗之后則須開瓶，降低瓶中濕度，增強(qiáng)光照強(qiáng)度，以便促使葉表面逐漸形成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機(jī)制，促使葉片逐漸啟動(dòng)光合功能等。 移栽： 先要輕輕地、徹底地洗掉沾在根上的瓊脂培養(yǎng)基，以免栽后發(fā)霉。要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，例如蛭石、河沙、珍珠巖、腐植土等。移栽后，最初10～15 d要通過噴霧或罩上透明塑料以保持很高的濕度(90%～100％)。 五、微繁中存在的一些問題 物種的局限性很多難于用傳統(tǒng)方法繁殖的重要樹木，包括若干裸子植物，離體繁殖技術(shù)還未過關(guān)。無性系變異 在商業(yè)性微繁當(dāng)中，一旦無菌培養(yǎng)已經(jīng)建立，人們就禁不住以此為起點(diǎn)連續(xù)繁殖若干世代，結(jié)果就有可能使培養(yǎng)早期發(fā)生的變異(芽變或偶然變異)累積起來。如果是通過愈傷組織進(jìn)行微繁的話，經(jīng)過長(zhǎng)