國(guó)家基金申請(qǐng)存在的問題和對(duì)策-文庫吧
2025-07-03 17:23 本頁面
【正文】 r 8 hr. Luciferase activities were measured as described in , The experiments were repeated three times with duplicates for each treatment. The data represent 177。 . of three experiments. 參 考 文 獻(xiàn) 1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li. Activity deprivationdependent induction of the proapoptotic BH3only protein Bim is independent of JNK/cJun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2022, 375：712. 2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease. Neurosci Res 2022； 48:195202 研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)與 擬解決的關(guān)鍵問題 要求：明確 具體 解決學(xué)術(shù)問題為目的 研究目標(biāo) 題目 ：神經(jīng)元凋亡時(shí) SP1對(duì) BH3only蛋白Bim的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 實(shí)例：獲得 SP1直接調(diào)控 bim基因表達(dá)的可靠證據(jù)，闡明促凋亡蛋白 Bim由 SP1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新機(jī)制，為確立 SP1作為神經(jīng)退行性疾病治療的新靶點(diǎn)提供更充分的科學(xué)依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容 （ 圍繞研究目標(biāo) ） 1. 證明 bim啟動(dòng)子核心區(qū)的 SP1結(jié)合序列是否介導(dǎo)了 bim基因的上調(diào) 為了證實(shí) bim啟動(dòng)子核心區(qū)的 SP1結(jié)合序列是否介導(dǎo)了 bim基因的上調(diào) ， 將其中的 SP1結(jié)合序列進(jìn)行點(diǎn)突變 ， 使其不能結(jié)合 SP1；確定這一突變是否能夠消除 bim啟動(dòng)子的撤鉀反應(yīng) 。 2. 分析 SP1 是否能夠與 bim啟動(dòng)子核心區(qū)的 SP1結(jié)合序列結(jié)合 應(yīng)用 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技術(shù) ， 證實(shí) bim啟動(dòng)子核心區(qū)的 SP1 結(jié)合序列是否能夠與 SP1結(jié)合；進(jìn)一步采用 CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法 ， 獲得 SP1與 bim啟動(dòng)子核心區(qū)在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的證據(jù) 。 3. 從 bim 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平 ， 觀察負(fù)顯性 SP1是否能夠抑制撤鉀誘導(dǎo)的 bim基因的上調(diào) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CGNs的轉(zhuǎn)染率只能達(dá)到 %， 腺病毒的感染率可達(dá) 70－ 80%[1]。 因此 ， 構(gòu)建 dnSP1的腺病毒載體 AddnSP1， 感染 CGNs才能達(dá)到可靠分析 bim的 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變的目的 。 4. 分析 SP1誘導(dǎo) Bim這一機(jī)制對(duì)神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用 確立 SP1轉(zhuǎn)錄激活 bim這一機(jī)制后，進(jìn)一步分析這一機(jī)制對(duì)神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用。 ? 項(xiàng)目需求為前提 ? 可靠性第一，先進(jìn)性第二 ? 參考文獻(xiàn) ? 突出關(guān)鍵技術(shù)的描述 ? 不主張使用流程圖，建議開頭： “ 有關(guān)方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)綜述如下 ……” 研究方案 基本方法 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)、 Western blot、RT－ PCR、鈣磷沉淀法轉(zhuǎn)染基因、轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元的凋亡分析、報(bào)道基因表達(dá)分析、免疫沉淀等基本方法均按我們報(bào)道 [1, 2, 3, 4, 5, 6]的進(jìn)行。 負(fù)顯性 SP1腺病毒 (AddnSP1)載體 的構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和保存 為了達(dá)到在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平（而不僅僅是人工的報(bào)道基因水平）觀察 dnSP1是否能夠抑制撤鉀誘導(dǎo) bim基因的上調(diào)的目的，必須保證 dnSP1導(dǎo)入 CGNs有較高的導(dǎo)入率?，F(xiàn)有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CGNs方法的轉(zhuǎn)染率只能達(dá)到 %，而在方法得當(dāng)?shù)那闆r下（見后）腺病毒的感染率可達(dá) 70－ 80%[1]。因此，dnSP1的腺病毒載體 AddnSP1的構(gòu)建是采用 RT－ PCR和 Western blot分析 bim的 mRNA和蛋白質(zhì)的前提。 …… 腺病毒的擴(kuò)增和純化按本人報(bào)道的進(jìn)行 [1]。腺病毒的活性高低是決定能否對(duì) CGNs達(dá)到 70－ 80％感染率的關(guān)鍵，而正確的腺病毒保存條件又是其活性高低的決定因素。我們?cè)?jīng)研究過儲(chǔ)存條件對(duì)腺病毒感染 CGNs的影響，并制定了腺病毒的最佳儲(chǔ)存條件，即小量分裝后置于－ 20?C/20%甘油或－80?C/50%甘油，一月內(nèi)可保證感染率在 7080%。 申請(qǐng)者簡(jiǎn)歷 申請(qǐng)者和項(xiàng)目組主要成員 ? 學(xué)歷 ? 研究簡(jiǎn)歷 ? 文章目錄 ? 學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì) ? 承擔(dān)的任務(wù) 黎明濤 (Li Mingtao) 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室教授，博士生導(dǎo)師，中山醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任。 1996年獲得博士學(xué)位，在美國(guó)科羅拉多大學(xué)從事 2年博士后工作。學(xué)科專業(yè)為分子神經(jīng)生物學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)，主要研究領(lǐng)域是神經(jīng)元凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)組學(xué)。近年來發(fā)表 SCI文章 36篇，其中作為
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