【正文】 ，連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，.），2,3,5三苯基氯化四氮唑（），硫酸（H2SO4，），磺胺（C6H8N2O2S，），濃鹽酸（HCl，），α萘胺（C10H9N，），亞硝酸鈉（NaNO2，），七水合硫酸亞鐵（FeSO47H2O，），硼酸（H3BO3，），硫酸錳（MnSO4，），七水硫酸鋅（ZnSO47H2O，），鉬酸（H2MoO4，.）五水硫酸銅（CuSO45H2O，）等。 水體、植物樣本采集方法 水體樣本采集方法 由于植物蒸騰作用以及水面的蒸發(fā)作用，在每次測定指標之前，用蒸餾水補水直到水面與標記線齊平，保證水體體積不變。用18個30ml的試劑瓶，標記后從各個桶中取約10ml的水樣，蓋好蓋子后，稀釋到25ml用水封住瓶口。取樣之后用蒸餾水補充10ml回每個桶。 植物樣本采集方法用四個干凈的塑料板，每個板做三個標記。，地上部分約1g。為減小誤差，每次每株植物都剪一片葉，數(shù)量相等的根。 浮床種植水芹及分組方法 長*寬*高約為5 dm* 4dm * dm的長方體容積為50L白色塑料桶共18個。放在實驗樓前竹林旁的空地。一般從上午9點到晚上6點能接受到光照。如果下雨，就用藍色防御布遮蓋。制作長*寬*高約為5dm*4dm*1cm 的長方體泡沫板，在泡沫板上用打孔器均勻地打上直徑約為1cm 的圓孔，用以作為支持水芹的浮床。在所有桶中加入15L不同污染水體后，把安放好水芹的泡沫板浮在水面上。： 取15桶校園內(nèi)九曲橋池塘內(nèi)河水，每桶 15L。 空白對照組：三組平行對照分別標記為（空白1，空白2，空白3） N過量；三組平行對照分別記為（N1，N2，N3） P過量：三組平行對照分別記為（P1，P2，P3） N、P都過量：三組平行對照分別記為（NP1，NP2，NP3） 河水：三組平行對照分別記為（河水1，河水2，河水3） 實驗時間安排從4月28日取來水芹的幼苗到4月30日種植到浮床之前都放在組培室中白色塑料桶中的完全培養(yǎng)液中作恢復培養(yǎng)。4月30日將水芹幼苗放在竹林旁邊的浮床上（幼苗穿過泡沫板的圓孔，根浸沒在水中），每個圓孔中大概放1到3株幼苗。從4月30日到5月28日每隔一周（每周一）取樣測指標。 植物指標測定方法一、方法：紅四氮唑法二、原理：氯化三苯基四氮唑（TTC）是一種氧化還原色素，溶于水中成無色溶液，但可被根系細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶等還原，生成紅色的不溶于水的三苯基甲鐟（TTF），因此，TTC還原強度可在一定程度上反應根系活力。三、實驗步驟：TTC標準曲線的制作　配制0、％、％、％、％、％的TTC溶液，各取5ml放入刻度試管中，各取5ml乙酸乙酯和少量Na2S2O4,（約2mg，各管中量要一致），充分振蕩后產(chǎn)生紅色的TTF，轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯層，待有色液層分離后，補充5ml乙酸乙酯，振蕩后靜置分層，取上層乙酸乙酯液，以空白作為參比，在分光光度計上于4485nm處測定各溶液的OD，然后以TTC質(zhì)量濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標繪制標準曲線。TTC還原量的測定 ，%TTC和66mmol/L磷酸緩沖液（）的等量混合液的試管中，37℃保溫3h，然后加入1mol/L硫酸1ml終止反應。取出根，小心擦干水分后與乙酸乙酯2～3ml和少量石英砂一起在研缽中充分研磨，以提取出TTF，過濾后將紅色的提取液移入10ｍl量筒，再用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌兩到三次，皆移入容量瓶，最后補充乙酸乙酯至5ml，用風光光度計于485nm處比色，以空白試驗（先加硫酸，再加根樣品）作為參比讀出OD，查標準曲線，即可求出TTC的還原量。計算 TTC還原強度=TTC還原量（g）/[根重（g）*時間（h）] 硝酸還原酶活性的測定方法 方法:活體法二、實驗原理 硝酸還原酶是植物氮素代謝作用中的關(guān)鍵性酶，與作物吸收和利用氮肥有關(guān)。它作用于NO3－使之還原為NO2－。 NO3—+NADH+H+→NO2—+NAD++H2O產(chǎn)生的NO2－從組織內(nèi)滲透到外界溶液中，并積累在溶液中，測定反應液中NO2－含量的增加，即表現(xiàn)該酶活性的大小。 NO2－含量測定可用磺胺（對氨基苯磺酸胺）比色法。在酸性溶液中NO2－與磺胺形成重氮鹽，再與及a－萘胺偶聯(lián)形成紫紅色偶染料。 反應液的酸度大則提高重氮化作用的速率，但降低偶聯(lián)作用的速率，顏色比較穩(wěn)定。升高溫度可以提高反應速率，但降低重氮鹽的穩(wěn)定度，所以反應需要在相同條件下進行。三、實驗步驟1．標準曲線的制作 取6支試管，編號，按下表操作 表3 硝酸還原酶活性的標準曲線制作 Table 3 manufacture of standard curve of nitrate reductase操作項目管 號1 2 3 4 5 6NaNO2淀標準液 (ml)0 蒸餾水(ml) 0NaNO2含量（μg）0 2 4 6 8 10磺胺(ml)各4α－萘胺 各4 搖勻在30℃水浴中保溫20分鐘。然后在520ml波長下比色測定消光值。以亞硝酸鈉含量為橫坐標，消光值為縱坐標繪制標準曲線。2．酶反應和酶活性測定將水芹葉片洗靜，吸干水分，剪成直徑為1cm的小片，洗滌2次，吸干后混勻后稱2份，分別置于含有下列溶液的20ml試管中:(1)+；(2)+ mol/。搖勻，置真空于燥器中，抽氣10分鐘。然后將三角瓶放人恒溫箱，在30℃暗條件下保溫30分鐘。分別吸取1ml反應液于２只試管中各加 2ml 1％磺胺和 ％a－萘胺。搖勻在30℃水浴中保溫20分鐘。然后在520nm波長下比色測定消光值。 硝態(tài)氮含量的測定方法一、方法：比色法二、原理 硝酸根還原成亞硝酸根后，與對氨基苯磺酸,a一萘胺結(jié)合，形成玫瑰紅色的偶氮染料，其顏色深淺與氮含量在一定范圍內(nèi)成正比關(guān)系，主要化學反應式如下：三、方法步驟：取恒重亞硝酸鈉（NaNO2），配成100μg/ml硝態(tài)氮溶液，隨后稀釋成10ug/ml。分別吸取2ml轉(zhuǎn)入50ml有塞試管中，加冰醋酸溶液18ml。并作試劑對照， g混合粉劑，劇烈搖動1分鐘，靜置10分鐘，將試管中懸濁液過量傾入離心管中，使部分流出管外，白色粉即可去除，離心5分鐘（4000rpm）。取上清液在520nm波長下比色測定，繪制標準曲線，本方法適用范圍在20ug/ml以內(nèi)。，剪成1—2mm的碎片，充分混勻置于干燥的三角瓶中，加入蒸餾水20ml，加塞進行激烈振蕩1—3分鐘，放置澄清后，取上清液2 ml，再按標準曲線制作方法測定，葉柄中硝態(tài)氮含量根據(jù)下述公式計算：植物組織中硝態(tài)氮含量（ug/g=）式中C為標準曲線上查得的組織提取液所含硝態(tài)氮（ug/ml）。V為1g植物組織所制備的提取液的總體積（ml），如本法為40ml。 總磷含量的測定方法一、方法：鉬藍法二、實驗原理：在酸性條件下,無機磷可與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨,并被氯化亞錫還原成藍色的磷鉬藍，由藍色的深淺即可測定磷的含量。H3PO4+12(NH4)MoO4+21HCl→ (NH4)3PO412MoO3 +21NH4Cl+ 12H2O(NH4)3PO412MoO3→ (MoO24MoO3)2H3PO44H2O鉬藍的最大吸收波長為660nm.三、步驟：繪制標準曲線。取標準磷溶液分別配成濃度為0、120181。g/ml磷溶液10ml，各取1ml于試管中，加入7ml水，再加入鉬酸銨硫酸試劑3ml，搖勻，混勻，靜置10~15min。 選擇660nm波長，用光徑1cm比色杯，以濃度0為參比溶液，測得各標準溶液的光密度。以磷濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。磷含量的測定取水芹葉2g于研缽中，加少許石英砂及2ml水研磨。將勻漿移至25ml容量瓶中，將研缽中殘渣一并洗入，然后加水至刻度。取該混合液于7000r/min條件下離心15min，取組織提取液1ml，如上步驟，測其光密度，由公式計算磷含量：P(181。g/g葉柄鮮重)=C(V/W)式中：C為提取液的磷含量（181。g/ml）；V為提取液的體積（ml）；W為樣品鮮重（g）。 水體指標測定方法 總氮 方法：過硫酸鉀氧化、紫外分光光度法二、原理在120℃~124℃的堿性基質(zhì)條件下，用過硫酸鉀作氧化劑，不僅可將水樣中氨氮和亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽，同時將水樣中大部分有機氮化合物氧化為硝酸鹽。而后，用紫外分光光度法分別于波長220nm與275nm出測定其吸光度，按下式計算硝酸鹽氮的吸光度，A=A2202A275，從而算出總氮含量，103L/（molcm）。三、 步驟（一）標準曲線的繪制1．分別吸取0、、用無氨水稀釋至10ml標線。2．加入5ml堿性過硫酸鉀溶液，塞緊磨口塞，用紗布及紗繩裹緊管塞，以防蹦出。3．比色管置于壓力蒸汽消毒器中，放氣使壓力指針回零。然后升溫至120~124℃開始計時。 4．自然冷卻，開閥放氣，移去外蓋。取出比色管并冷卻至室溫。5．加入（1+9）鹽酸1ml，用無氨水稀釋至25ml標線。6．在紫外分光光度計上，以新鮮無氨水作參比，用10mm石英比色皿分別在220nm及275nm波長處測定吸光度。用校正的吸光度繪制標準曲線。（二）樣品的測定步驟 取適量經(jīng)預處理的水樣（使氮含量為20~80ug）。按標準曲線繪制步驟（2）~（6）操作。然后按校正吸光度，在校準曲線上查出相應的總氮量，再計算總氮含量。一、方法:孔雀綠磷鉬雜多酸分光光度法[14]二、原理：酸性條件下，利用堿性染料孔雀綠與磷鉬雜多酸生成綠色離子締合物，并以聚乙烯醇穩(wěn)定顯色液，直接在水相用分光光度法測定正磷酸鹽。其摩爾吸光系數(shù)為105L/（molcm）。三、步驟水樣預處理：取混勻水樣25ml于具塞比色管中，加4ml 5%過硫酸鉀溶液，加塞并用紗布包扎好，置于壓力鍋中，于120℃下消解30min，取出放冷，供水中總磷測定。標準曲線的繪制：，，，，加水至25ml，再加入5ml的顯色劑及1ml1%PVA溶液，混勻，放置30 min后，于620 nm波長處以試劑空白為參比，進行吸光度測量，得到吸光度磷含量標準曲線。樣品測定：取經(jīng)過預處理的適量水樣（含磷量不超過15μg），用水稀釋至標線，按繪制標準曲線的步驟進行顯色和檢測，計算待測水樣的磷含量。 一、方法：N(1萘基)N二胺光度法二、原理在磷酸介質(zhì)中，177。，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酰胺反應，生成重氮鹽，再與N（1萘基）乙二胺偶聯(lián)生成紅色染料。在540nm波長處有最大吸收。三、步驟 在一組6支50ml比色管中，分別加入0、用水稀釋至標線。，密塞，混勻。靜置20min后，在2h以內(nèi)，于波長540nm處，用光程長10mm比色皿，以水為參比，測量吸光度。從測得的吸光度，減去零濃度空白管的吸光度后，獲得校正吸光度，繪制以氮含量（μg）對校正吸光度的校準曲線。2．水樣的測定 當水樣pH≥11時，可加入1滴酚酞指示液，邊攪拌邊逐滴加入（1+9）磷酸溶液，至紅色剛消失。 水樣入有顏色和懸浮物，可向每100ml水中加入2ml氫氧化鋁懸浮液，攪拌，靜置，過濾，棄去25ml初濾液。 分取經(jīng)預處理的水樣入50ml比色管中（如含量較高，則分取適量，用水稀釋至標線），然后按校準曲線繪制的相同步驟操作，測量吸光度。經(jīng)空白校正后，從校準曲線上查得亞硝酸鹽氮量。3. 空白試驗 用實驗用水代替水樣，按相同步驟進行全程序測定。一、方法：次氯酸鹽光度法二、原理：在亞硝基鐵氰化鈉存在下，銨與水楊酸鹽和次氯酸離子反應生成藍色化合物，其色度和氨氮含量成正比，在波長697nm具最大吸收。三、步驟：（1）標準曲線的繪制吸取0、、用水稀釋至約8ml，在滴加2滴次氯酸鈉溶液，稀釋至標線充分混勻，放置1h后，在波長697nm處用光程為10mm的比色皿，以水為參比，測量吸光度。（2）水樣的測定分取適量經(jīng)預處理的水樣（使氨氮含量不超過8ug）至10ml比色管中，加水稀釋至約8ml，與標準曲線相同操作，進行顯色和測量吸光值。（3）空白實驗以無氨水代替水樣，按樣品測定相同步驟進行顯色和測量。四、計算：從標準曲線上查得氨氮含量 統(tǒng)計分析 用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，各組間差異均采用獨立樣本t檢驗進行分析。數(shù)據(jù)全部表示為平均值177。標準誤差(Mean177。SE)，n＝3，P，P。 本章小結(jié)本章列舉了本研究實驗所需的實驗材料、器材、試劑。植物的四個生理指標（根系活力、硝酸還原酶活性、硝態(tài)氮含量和總磷含量）和水體四個指標（ 總氮含量、正磷酸鹽含量、亞硝酸鹽含量、氨氮含量）的測定方法，以及實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法。第3章 結(jié)果與分析 根系活力的變化與分析 表 4 四種水體中水芹根系活力在四周內(nèi)變化情況[g/(gh)] Table 4 Cress root activity in kind of water changes within four weeks of the significant variance analysis水體種類河水NPNP第一周177。177。177。 177。 第二周177。177。 177。 177。 第三周177。177。 177。 177。 第四周177。177。 177。 177。 第五周177。177。 177。 177。 注：各組與河水組縱向比較