質(zhì)粒dna提取純化與驗證-文庫吧
2025-06-04 05:09 本頁面
【正文】 電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應越低。4)電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應小于5 V／cm。5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。當電泳液為去離子水(如不慎誤用去離子水配制凝膠)，溶液的導電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下(如錯用10電泳緩沖液)，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性。電泳時常用的緩沖液有乙酸鹽（TAE）、硼酸鹽（TBE)和磷酸鹽（TPE）幾種不同的緩沖液，通常配制成10或5的濃度母液保存于室溫下，用時稀釋至工作濃度。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽極變堿性，陰極變酸性），長時間電泳需要更換緩沖液。TAE緩沖液可以分離數(shù)KB長度的DNA，在精致DNA片段以及染色體DNA進行雜交時經(jīng)常使用。 6)溫度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大小DNA片段的相對電泳遷移率在4～30℃內(nèi)無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進行，而當瓊脂糖含量少于0．5％時，凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強度?！緦嶒瀮x器、材料及試劑】 儀器和材料接種環(huán)，培養(yǎng)皿，酒精燈，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，漩渦振蕩器，微量移液器及多型號槍頭，微波爐，電泳儀等菌體： DH5α受體菌，具有Ampr標記的質(zhì)粒pUC19。Maker: λ/Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker 點樣對照組： pUC19/ Hind II雙鏈線性DNA PUC19（商品） λDNA 實驗試劑LB培養(yǎng)基，抗生素（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3mol/L NaAc溶液，預冷無水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液，TAE電泳緩沖液（10），溴化乙錠（EB)，上樣緩沖液（6）。溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM TrisHCl(pH )，10mM EDTA(pH ）。(1M TrisHCl， pH ； EDTA 10ml pH ，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min ，貯存于4℃)。溶液Ⅱ： NaOH，1% SDS。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性）。溶液Ⅲ：5M醋酸鉀（KAc）緩沖液60ml，，溶液中濃度K+3M,Ac5M?！緦嶒灢襟E】擴增質(zhì)粒（菌體培養(yǎng)） 1） DH5α菌，37℃恒溫倒置培養(yǎng)1618hr；之后，挑取單菌落，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基（含Ampr80ug/ml）中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜1214hr；再轉(zhuǎn)接一次，進行50或100倍稀釋，同樣37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)46hr。2）對50mL的離心管稱重（記為m1），取菌液30ml配平，6000rpm離心5min，棄去上清液；加入5ml溶液Ⅰ混勻，6000rpm離心5min,棄去上清液。取離心管稱重（記為m2)，可測得菌體重量W=m2m1。提取質(zhì)粒 1）向離心管中加入溶液Ⅰ（），漩渦混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅱ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅲ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min；離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管（記體積為v1) 2）加入2v1冰乙醇，顛倒混勻，20℃保存30min，12000rpm離心15min,棄上清液,將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。向沉淀中加入5mL70%乙醇進行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復洗滌一次； 37℃下保存5min,至離心管內(nèi)干燥，加入1mlTE緩沖液溶解，得粗提物，將粗提物轉(zhuǎn)移至新EP管，加入100ugRNase A（10ug/ul),將EP管放置于3
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