高效毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用-文庫(kù)吧
2025-04-15 18:03 本頁(yè)面
【正文】 分析手段； 圖，酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離； 蛋白質(zhì)的尺寸分離 蛋白質(zhì)的尺寸分離或分子量測(cè)定，是化學(xué)等研究中的重要工作，通常利用超速離心、 質(zhì)譜 、凝膠排斥色譜、 SDSPAGE等方法完成。利用毛細(xì)管電泳有較其他方法的優(yōu)點(diǎn)： １ . 只需消耗納升級(jí)的樣品； ２ . 可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行重復(fù)和自動(dòng)化的測(cè)定 ３ . 如果能獲得準(zhǔn)確的分子量標(biāo)準(zhǔn)，可以比較準(zhǔn)確的測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量； ４ . 利用紫外等進(jìn)行柱上檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)定量分析等； 蛋白質(zhì)尺寸分析的關(guān)鍵，首先是篩分介質(zhì)的選擇，其次是緩沖體系的確定，此外還需需要仔細(xì)考慮進(jìn)樣、分離電壓和電泳溫度等因素。 常用的篩分介質(zhì)有兩大類，一是各種凝膠，應(yīng)用于 CGE,適合于蛋白質(zhì)分離的凝膠有線性聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖等。二是水溶性高分子溶液或稱非膠篩分介質(zhì)，用于NGCE，最好選用紫外透明或吸收較弱的高分子，例如葡聚糖、聚乙二醇等。 蛋白質(zhì)對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附某種程度上限制了毛細(xì)管電泳在該領(lǐng)域的應(yīng)用。 影響毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)效率及重現(xiàn)性的最主要因素是毛細(xì)管壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附 , 吸附作用的大小取決于毛細(xì)管材料、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、緩沖溶液的 pH 值等多種因素。 存在的問題 毛細(xì)管內(nèi)壁對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附的原因 毛細(xì)管電泳中的蛋白質(zhì)吸附 , 可源于疏水作用、靜電作用和其它多種兩相分配機(jī)制。通常情況下堿性蛋白的靜電吸附最為突出 ,在常用緩沖溶液的 pH 下 ( pH= 4~ 8) , 管內(nèi)壁的硅羥基發(fā)生解離 , 使管內(nèi)壁帶負(fù)電荷 ,蛋白質(zhì)在低于等電點(diǎn)時(shí)會(huì)帶上正電荷 , 在高于等電點(diǎn)時(shí)帶負(fù)電荷。 若緩沖溶液的 pH 值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn) , 蛋白質(zhì)則吸附 H+ 而帶正電荷 , 由于靜電相互作用 ,蛋白質(zhì)與管壁發(fā)生吸附當(dāng) pH 值增大到接近等電點(diǎn)時(shí) , 蛋白質(zhì)顯中性 , 不帶電 。 pH 值繼續(xù)增大 ( 超過等電點(diǎn) ) , 蛋白質(zhì)帶負(fù)電 , 此時(shí)與毛細(xì)管壁的 Si O 產(chǎn)生排斥作用 , 不再發(fā)生吸附。 ( a) 堿性蛋白質(zhì) ( pI= 8) 所帶電荷量隨 pH 的變化曲線 。 ( b) 在 pH= 4 時(shí) , 堿性蛋白質(zhì) ( pI= 8) 與毛細(xì)管壁發(fā)生吸附 解決辦法 極端 pH值法 緩沖溶液 pH 值通過影響柱壁與溶質(zhì)的電荷差異 , 從而改變其間的相互作用。 在低pH 下 , 硅羥基主要以不帶電的質(zhì)子化形式存在 , 壁電荷非常小 , 可以減少吸附。在高pH 值下 , 內(nèi)壁表面 SiOH 基大部分電離帶負(fù)電荷 , 與溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生庫(kù)侖排斥作用 , 從而有效地抑制了管壁的吸附。 添加小分子添加劑 在 CE 分離中 , 除了背景電解質(zhì)外 , 常常還在緩沖溶液中添加某種成分 , 常用添加劑有 : 表面活性劑 , 如季銨鹽和氟化的陽(yáng)離子表面活性劑 。 中性鹽 , 如磷酸鹽、硫酸鉀等 。 胺類 , 三乙醇胺 、三乙胺、 N乙基二乙醇胺 、 N , N, N?? , N?? 四甲基 1, 3 丁二胺 ( TMBD) 等 。 有機(jī)溶劑 , 包括醇類、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二甲亞砜等。 上述兩種方法只能從一定程度上降低蛋白質(zhì)吸附 , 而且 pH 值過高 ( 或過低 ) , 小分子添加劑濃度過大都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和變性。 3 、聚合物涂覆毛細(xì)管內(nèi)壁抑制蛋白質(zhì)吸附 化學(xué)鍵合涂層的涂覆過程如圖 2 所示 , 一般分為兩大步 : 首先 , 硅烷化試劑與毛細(xì)管內(nèi)壁的 Si OH反應(yīng)生成 Si O Si 結(jié)構(gòu)固定在管壁內(nèi)表面 。 然后 , 通過硅烷化試劑末端雙鍵與適宜單體共聚生成聚合物覆蓋在毛細(xì)管內(nèi)表面 , 形成永久涂層。 常見的化學(xué)鍵合聚合物涂層有以下幾種 : 聚丙烯酰胺 ( PAA) 聚乙烯醇 ( PVA) 聚乙二醇 ( PEG) 聚 N , N二甲基丙烯酰胺 ( PDMA) 通過共價(jià)鍵與毛細(xì)管壁結(jié)合的涂層壽命長(zhǎng) , 穩(wěn)定性好 , 分離效率高 , 已在毛細(xì)管電泳中獲得廣泛應(yīng)用 , 但是化學(xué)鍵合的過程中涉及毛細(xì)管硅烷化和引發(fā)單體聚合兩步反應(yīng) , 一方面受兩步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率影響 , Si OH 很難被完全屏蔽 。 另一方面 , 毛細(xì)管內(nèi)的聚合反應(yīng)很難控制 , 容易造成涂層的不均一性、不規(guī)整性 , 甚至阻塞毛細(xì)管。 化學(xué)鍵合的交聯(lián)的 PVA 涂層對(duì) 4 種堿性蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)第 2 次和第 902 次分離的電泳圖譜 樣品濃度 : 50u
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