高效毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用(完整版)
【正文】 . Email: 一、概述 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展 及各種新型蛋白質(zhì)類生化藥物的相繼問世．傳統(tǒng)的 SDS一聚丙烯酰胺電泳及常規(guī)的液相色譜技術(shù)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)大規(guī)模藥物生產(chǎn)過程分析與產(chǎn)品純度檢驗(yàn)的需要， 而毛細(xì)管電泳 (HPCE)技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一種新型分離、分析技術(shù)。 ? 常用于蛋白質(zhì)、 DNA等的分離，是 DAN排序的重要手段。 ? 蛋白的鑒別分析通常包括對(duì)氨基酸的組成和序列、一些物化常數(shù)如分子量和等電點(diǎn)等的測(cè)定，以區(qū)分和鑒定結(jié)構(gòu)和種類不同的蛋白質(zhì) 氨基酸與蛋白質(zhì)分析 analysis of amino acids 蛋白質(zhì)分析 核酸分析及 DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA 重要分析手段； 圖，酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離； 蛋白質(zhì)的尺寸分離 蛋白質(zhì)的尺寸分離或分子量測(cè)定，是化學(xué)等研究中的重要工作，通常利用超速離心、 質(zhì)譜 、凝膠排斥色譜、 SDSPAGE等方法完成。 若緩沖溶液的 pH 值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn) , 蛋白質(zhì)則吸附 H+ 而帶正電荷 , 由于靜電相互作用 ,蛋白質(zhì)與管壁發(fā)生吸附當(dāng) pH 值增大到接近等電點(diǎn)時(shí) , 蛋白質(zhì)顯中性 , 不帶電 。 胺類 , 三乙醇胺 、三乙胺、 N乙基二乙醇胺 、 N , N, N?? , N?? 四甲基 1, 3 丁二胺 ( TMBD) 等 。分離條件 : 毛細(xì)管 , 內(nèi)徑 50μm, 總長 48cm( 有效長度 40cm) 。可采用非涂層管，以大分子聚乙二醇為篩分介質(zhì)，以 NGCE模式進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的檢測(cè)。 2nm ? 時(shí)間常數(shù)： ? 掃描速度：全程范圍掃描速度： 100nm/s ? 模擬輸出： 177。 % ? 光路系統(tǒng)：衍射光柵單色儀，光電二極管 ? 波長范圍： 190～ 700nm，連續(xù)可調(diào) ? 燈 源：日本濱松 L6302氘燈 ? 波長精度： 177。 %ABS 紫外檢測(cè)器 ? 光路系統(tǒng)：衍射光柵單色儀，光電二極管 ? 波長范圍： 190～ 700nm，連續(xù)可調(diào) ? 波長精度： 177。 1nm ? 衰減范圍： ～ 2AU/mv 10檔 ? 噪 音： 177。 1nm ? 衰減范圍： ～ 2AU/mv 10檔 ? 噪 音： 177。 105AU在 254nm， t=1s ? 基線漂移： 177。 10%， 輸出電壓變化 % ? 負(fù)載調(diào)節(jié)： 10V/100A ? 紋 波： 輸出電壓的 % PP ? 電壓示值誤差： ≤% ? 電流示值誤差： ≤% ? 穩(wěn)定度變化： ≤% CL101A 智能高壓電源正 CL101B 智能高壓電源負(fù) CL101C 智能高壓電源正負(fù) CL101E高壓電源正 CL1020高效毛細(xì)管電泳儀紫外檢測(cè)器 包含： 國產(chǎn)紫外檢測(cè)器 電泳機(jī)箱 高壓電源 工作站 紫外檢測(cè)池 工作原理 紫外檢測(cè)原理基于被測(cè)組分和背景電解質(zhì)的吸光度不同，當(dāng)被測(cè)組分通過檢測(cè)窗時(shí)，吸光度發(fā)生的變化服從朗伯 比爾定律，即在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，吸光度與被測(cè)組分的濃度成正比。 緩沖液 , 40mM 磷酸鈉 。 上述兩種方法只能從一定程度上降低蛋白質(zhì)吸附 , 而且 pH 值過高 ( 或過低 ) , 小分子添加劑濃度過大都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和變性。 ( a) 堿性蛋白質(zhì) ( pI= 8) 所帶電荷量隨 pH 的變化曲線 。 常用的篩分介質(zhì)有兩大類，一是各種凝膠，應(yīng)用于 CGE,適合于蛋白質(zhì)分離的凝膠有線性聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖等。 ? 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。該技術(shù)在生物大分子、無機(jī)離子、光學(xué)異構(gòu)體及有機(jī)藥物分離、分析方面獲得了廣泛的應(yīng)用 。 毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ， CGE ? 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。 影響毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)效率及重現(xiàn)性的最主要因素是毛細(xì)管壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附 , 吸附作用的大小取決于毛細(xì)管材料、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、緩沖溶液的 pH 值等多種因素。在高pH 值下 , 內(nèi)壁表面 SiOH 基大部分電離帶負(fù)電荷 , 與溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生庫侖排斥作用 , 從而有效地抑制了管壁的吸附。
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