【正文】 曲線 管號 1 2 3 4 5 6 7 亞硝酸納標準液 ml 00 02 04 08 12 16 20 蒸餾水 ml 20 18 16 12 08 04 00 1 磺胺 ml 40 40 40 40 40 40 40 002 萘基乙烯胺 ml 40 40 40 40 40 40 40 每管含亞硝態(tài)氮μ g 00 02 04 08 12 16 20 二樣品測定 酶的提取取鮮樣 05g剪碎于研缽中 置于低溫冰箱 30min取出置冰浴中 加少量石英砂及 4ml提取緩沖液研磨成漿 4℃ 4000rpm離心 5min上清液為粗酶提取液 酶的反應(yīng)取提取液 04 ml 于 10 ml 試管加入 12 ml 01molL KNO3 溶液和04mlNADH 溶液混勻 25℃水浴中保溫 30min 對照不加 NADH 溶液而以 04ml 01molL pH75 的磷酸緩沖液代替 保溫結(jié)束后立即加入 1 ml 磺胺終止酶反應(yīng)再加 1ml 萘基乙烯胺溶液顯色15min 后 4000rpm 離心 5min 取上清液測吸光值 四．結(jié)果計算
[μg g h ] 式中 x 為反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量 μ g V1 為提取酶時加入的緩沖液體積 ml V2 為酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積 ml W 為樣品鮮重 g t 為反應(yīng)時間 h 23 蔗糖轉(zhuǎn)化酶測定 35二硝基水楊酸法張言芳 一儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計容量瓶 100 ml 移液器離心管和離心機 水浴鍋溫度計烘箱濾紙?zhí)炱?25 ml 的具塞試管 二試劑 1 mgml 葡萄糖標準溶液準確稱取 100 mg 無水葡萄糖預(yù)先在 105℃干燥至恒重用少量水溶解后轉(zhuǎn)移到 100 ml 容量瓶中定容至刻度搖勻 100 gL NaOH 水溶液 DNS 試劑 精確稱取 35－二硝基水楊酸 1 g 溶于 20 ml 1 molL NaOH 中加 50 ml 蒸餾水再加入 30g 酒石酸鉀鈉溶解后蓋緊瓶塞勿使 CO2 進入 磷酸鹽緩沖溶液 pH6801 molL Na2HPO4 491 ml 和 01 molL KH2HPO4 509 ml混勻 100 gL 蔗 糖溶液稱取 10 g 蔗糖溶于少量水中轉(zhuǎn)入 100 ml 容量瓶中加 10 ml磷酸鹽緩沖溶液 pH68 用水稀釋至刻度 二實驗步驟 1 標準曲線繪制 準確吸取葡萄糖標準溶液 00204060810 ml 相當于 00204060810mg 葡萄糖分置 6 支 25 ml 的具塞比色管中各加水至 20 ml 各加 35二硝基水楊酸試劑 15 ml置沸水浴中 5 min 取出后立即用冷水冷卻至室溫再用水將各管定容至刻度 立即于 520 nm 波長處用 1 cm 比色皿以試劑空白作參比測定吸光度根據(jù)測得的吸光度值繪制標準曲線或計算直線回歸方程 2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性 的測定 稱取 05 g 煙葉用水研磨并定容至 6 ml 然后在 3000 rmin 離心 10 min 定容由后面的吸光值確定定容多少體積 混合液吸取 10 ml 酶液和 10 ml 蔗糖溶液混勻吸取此混合溶液 5 ml 用水稀釋并定容至 100 ml 容量瓶中 轉(zhuǎn)化液取混合液 8 ml 于 45℃水浴中轉(zhuǎn)化 1 h 取出立即快速冷卻至室溫吸取混合液和轉(zhuǎn)化液各 1 ml 分置 25 ml 的具塞試管中各加水至 2 ml 各加 35 二硝基水楊酸試劑 15 ml 在沸水溶中 5 min 取出后立即用水冷卻至室溫再用水將各管定容至刻度立即于 520 nm 波長處用 1 cm 比色皿以 試劑空白作參比測定吸光度 3 計算 N nAWV200 M nAWV200 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性 mgg 102 MN 式中 M 轉(zhuǎn)化后單糖 mgg N 轉(zhuǎn)化前單糖 mgg A 從標準曲線上查得的葡萄糖含量 mg W 樣品質(zhì)量 g V 測定用樣品體積 ml N 稀釋倍數(shù) 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性單位 mgg 在 1g 煙葉作用下能使蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖的 mg 數(shù) 24 蔗糖合酶孔霖 一實驗原理 蔗糖合酶催化反應(yīng) UDPG 果糖 蔗糖 UDP 這是一個可逆反應(yīng)平衡常數(shù)為 1320 該酶在分解方向的 Km 值相對 較高30150mmolL 細胞中高的蔗糖濃度有利于反應(yīng)向分解方向進行蔗糖合酶活性測定既可在合成方向進行測定外加底物 UDPG 和果糖測產(chǎn)物蔗糖的量表示酶活性也可以在分解方向進行測定外加蔗糖和 UPD 測定果糖含量表示酶活性 二儀器設(shè)備及設(shè)備 冷凍離 心機 恒溫 水浴 分光 光度計 研缽 一套 磁力 攪拌 器天 平感量001mg010515 ml 移液管各 1 個 10ml 具塞試管 10 支 5ml 量瓶一個冰箱 三試劑配制 1 提取緩沖液 100 mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 5 mmolL MgCl2 2mmolL EDTANa2 2 乙二醇 02 牛血清蛋白 BSA2 PVP5 mmolL DTT 2 透析緩沖液 25mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 25mmolL MgCl2 1mmolL EDTANa2 1 乙二醇 1mmolL DTT 3 酶反應(yīng)液 100mmolL TrisHCl pH70 緩沖液內(nèi)含 10mmolL 果糖 2mmolL EDTANa2 5mmolL 醋酸鎂 5mmolL DTT 4 10mmolL UDPG 稱取 0012206 g UDPG 配成 2ml 濃度計為 10molL UDPG 隨配隨 用 5 2molL NaOH 6 30 HCl 7 01 間苯二酚 01g 間苯二酚溶于 100ml 95 乙醇中棕色瓶保存 8 1mgml 蔗糖標準液 四實驗步驟 1 酶液制備 稱取 1g植物葉片置于預(yù)冷的研缽中分批加入 5ml提取緩沖液冰浴研磨提取 2℃ 10000 轉(zhuǎn)離心 20min 上清液 3ml 裝入透析袋中透析袋置于透析緩沖液中 4℃透析過夜期間更換透析液 3 次透析后酶液定容 5ml 備用 2 蔗糖合酶活性測定取 3 支 10ml 具塞試管加入 04ml 酶反應(yīng)液 01ml UDPG和 005ml 透析后的酶液補水至 1ml 于 30℃水浴中反應(yīng) 10min 后沸水浴 3min 中止反應(yīng)對照用蒸餾水代替 UDPG 3 蔗糖含量測定往各反應(yīng)試管中加入 2molL NaOH 01 ml 沸水浴 10 min 后冷卻至室溫加 30