【正文】 10 kb ? 23 kb ? 45 kb ? BAC ? 300 kb 用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 25 載體與基因組 DNA的切割 ?用于基因組文庫構(gòu)建的 DNA片段的切割 一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法 ，其目的是： ?第一 保證 DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。 ?第二 保證 DNA片段大小均一。 ?超聲波處理后的 DNA片段 呈平頭末端 ，需加裝人工接頭。 ?部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，這樣DNA酶解片段的大小可控。 ?連接前，上述處理的 DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的 DNA片段隨機(jī)連為一體。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 26 載體與外源片段的連接 （ 1） 連接酶 ? DNA連接酶； T4 DNA連接酶； DNA連接酶 它們都可以催化 5’末端磷酸和 3’末端羥基形成磷酸二酯鍵 。 但由于 T4 DNA連接酶既能連接粘性末端還能連接平末端 ， 而 DNA連接酶主要連接粘性末端 ， 所以一般連接反應(yīng)中都用 T4 DNA連接酶 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 27 （ 2）連接反應(yīng)的效率 ? 連接反應(yīng)的效率和連接產(chǎn)物的組成與 DNA末端的特性 、DNA末端的濃度 以及所用的 連接酶量 有關(guān)。 ?平末端連接反應(yīng)的效率相對較低 ， 它需要較高濃度的平末端 、 較大的連接酶量 、 較低濃度的 ATP以及不能有象亞精胺一類的多胺 。 ?在連接反應(yīng)中加入 15％ 的 PEG 8000或 1～ ／ L 氯化六氨合鈷 等濃縮劑可極大地促進(jìn)平末端反應(yīng)的連接速度 ， 同時(shí)可改變不同連接產(chǎn)物的比例 ， 使連接產(chǎn)物增多 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 28 （ 3）避免 外源 DNA片段之間的連接 措施 ? 在基因組 文庫的構(gòu)建過程中， 最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源 DNA片段之間的連接?。。? ? 為了避免上述情況的發(fā)生， 可采取下列措施的組合： ? 將待連接的 DNA片段根據(jù)載體的裝載量 分級分離 ? 用堿性磷酸單酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基團(tuán) ? 用酶在 DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 29 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 30 重組 DNA導(dǎo)入宿主及篩選 ? 轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)導(dǎo) ? 轉(zhuǎn)染 ? 感染 ? 結(jié)合 ? 其它 2022/2/12 31 密集鋪板（ 110萬） ? 雜交 ? 挖取 目的重組克隆 ? 鋪板 ? 鋪板 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 32 構(gòu)建噬菌體基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 33 用粘粒載體建立基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 34 基因組文庫重組克隆的排序 ? 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè) YAC基因文庫的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段 DNA序列。 ? 然而基因文庫的克隆都是隨機(jī)序列，必須將所有的克隆排列成一個(gè)像天然染色體 DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 35 （ 1）酶切片段末端標(biāo)記法 ? 將單一的 YAC克隆插入 DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。 ? 然后再用 Sau3A I或 Mbo I將末端標(biāo)記的 DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每 10個(gè) YAC克隆走在同一塊板上，形成 10個(gè)克隆的特征性 DNA指紋圖譜 ? 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆 DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè) YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè)YAC克隆的 DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 36 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 單一克隆指紋圖譜 十克隆指紋圖譜 載體 DNA 克隆 DNA 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 37 （ 2）隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法 ? 將若干 YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成 20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的。 ? 用 20種探針隨機(jī)定位雜交（一對一） 20份 YAC克隆薄膜。 ? 如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“ 1” ，而陰性結(jié)果記為“ 0” ，可清晰地列成一張表，最終排出上述 YAC克隆的排列順序 。 2022/2/12 38 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2022/2/12 39 01 04 12 06 13 14 02 17 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 2022/2/12 40 （ 3）染色體走讀法（ chromosome walking） ? 從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在 ~ kb范圍內(nèi) ? 分別以上述亞克隆 DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入 DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的 DNA片段連鎖在一起 ? 然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體 DNA的端點(diǎn) 2022/2/12 41 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 亞克隆旁測序列 探針標(biāo)記 第一輪雜交 陽性克隆 陽性克隆 第二輪雜交 第二輪雜交 2022/2/12 42 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 2022/2/12 43 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 構(gòu)建了基因文庫僅僅是完成了基因克隆，并不等于完成了基因分離。構(gòu)建成的文庫僅是一個(gè)雜亂無章的“基因圖書館”，要想從中找到所需基因，必須有一些相關(guān)線索。分離目的基因也要知道與目的基因有關(guān)的某些或某個(gè)特征，才能據(jù)此找到相關(guān)基因。主要方法有： ?核酸雜交方法； ?免疫學(xué)檢測方法； ?DNA同胞選擇法（極少用）； ?PCR篩選法； ?其他方法。 2022/2/12 44 （ 1）核酸雜交方法 ? 適用于大量篩選，常用，可靠。但需制備探針，所用探針有多種，獲得探針的方法很多； （ 2）免疫學(xué)檢測方法 （ 3） DNA同胞選擇法（極少用） 使用抗體探針，通過檢測重組克隆表達(dá)出的蛋白質(zhì)來篩選目的克隆。只適用于表達(dá)文庫的篩選，并只能篩選出表達(dá)了的克隆。 DNA同胞選擇法是按矩陣分值亞庫，用 mRNA與 cDNA雜交后釋放出 mRNA ，使其在無細(xì)胞蛋白合成體系中翻譯，并對翻譯產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀、 PAGE電影鑒定或活性分析等來篩選目的快樂，該方法要求全長 cDNA，一般只在無其他方法可用或表達(dá)產(chǎn)物很小時(shí)才用 2022/2/12 45 （ 4） PCR篩選法 ? 其顯著特點(diǎn)是快速、簡便。該方法的基本策略是采用“反應(yīng)池” ，將基因文庫分裝 96孔培養(yǎng)板，如有 2304個(gè)克隆分別置于 24個(gè) 96孔培養(yǎng)板中，現(xiàn)以反應(yīng)板為單位，將 96個(gè)克隆混合成一個(gè)“反應(yīng)池”，進(jìn)行一個(gè) PCR反應(yīng)，如圖： 2022/2/12 46 ? 從 24個(gè)反應(yīng)板中找出具 有陽性克隆 的反應(yīng)板，再將該板中的 12個(gè)橫向克隆與 8個(gè)縱向克隆分別混合，形成 12個(gè)橫向池及 8個(gè)縱向池，進(jìn)行 20個(gè)（ 8+12）反應(yīng)，如圖，橫向陽性池與縱向陽性池交叉的孔為陽性單克隆，通過44個(gè)反應(yīng)可從 2304個(gè)克隆中篩選分離出單個(gè)克隆。 2022/2/12 47 大腸桿菌作為寄主進(jìn)行 DNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案 DNA片段 的獲得 載體構(gòu)建 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 重組體 的鑒定 限制性內(nèi) 切酶消化 機(jī)械切割 雙鏈 cDNA 的合成 化學(xué)法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 連接 平末端 連接 加接頭造成 粘性末端 重組噬菌體 DNA轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒 的轉(zhuǎn)化 體外包裝 進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo) 表型鑒定 核酸雜交 免疫學(xué)分析 酶切鑒定 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 48 ? 圖克隆策略的一般總結(jié)，箭頭顯示了最佳路線。 注意，在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的克隆策略中，DNA最初是由非特異性的方法并克隆的，因此在結(jié)尾步驟需要篩選出目標(biāo)克隆。相反地，當(dāng)特異性的 DNA片段是通過 PCR或直接化學(xué)合成的方式獲得的時(shí)候，也就不需要后續(xù)的篩選了。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 49 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? 通過 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 50 3 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? cDNA文庫的構(gòu)建 ? cDNA克隆的操作流程 2022/2/12 51 . cDNA 以 mRNA為模板 逆轉(zhuǎn)錄 出的 DNA稱 cDNA。 . cDNA library mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 利用某種生物的 總 mRNA合成 cDNA，再將這些 cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱 cDNA文庫。 cDNA文庫的構(gòu)建 2022/2/12 52 （ 1） 不含內(nèi)含子序列 。 （ 2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。 （ 3）包含了所有 編碼蛋白質(zhì)的基因 。 （ 4）比 DNA文庫小 的多，容易構(gòu)建。 . 構(gòu)建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1）總 RNA（ total RNA）提取