【正文】 10 kb ? 23 kb ? 45 kb ? BAC ? 300 kb 用于基因文庫構建的受體則根據載體使用大腸桿菌或酵母菌 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 25 載體與基因組 DNA的切割 ?用于基因組文庫構建的 DNA片段的切割 一般采用超聲波處理和限制性內切酶部分酶切兩種方法 ，其目的是： ?第一 保證 DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。 ?第二 保證 DNA片段大小均一。 ?超聲波處理后的 DNA片段 呈平頭末端 ，需加裝人工接頭。 ?部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內切酶，這樣DNA酶解片段的大小可控。 ?連接前，上述處理的 DNA片段必須根據載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的 DNA片段隨機連為一體。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 26 載體與外源片段的連接 （ 1） 連接酶 ? DNA連接酶； T4 DNA連接酶； DNA連接酶 它們都可以催化 5’末端磷酸和 3’末端羥基形成磷酸二酯鍵 。 但由于 T4 DNA連接酶既能連接粘性末端還能連接平末端 ， 而 DNA連接酶主要連接粘性末端 ， 所以一般連接反應中都用 T4 DNA連接酶 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 27 （ 2）連接反應的效率 ? 連接反應的效率和連接產物的組成與 DNA末端的特性 、DNA末端的濃度 以及所用的 連接酶量 有關。 ?平末端連接反應的效率相對較低 ， 它需要較高濃度的平末端 、 較大的連接酶量 、 較低濃度的 ATP以及不能有象亞精胺一類的多胺 。 ?在連接反應中加入 15％ 的 PEG 8000或 1～ ／ L 氯化六氨合鈷 等濃縮劑可極大地促進平末端反應的連接速度 ， 同時可改變不同連接產物的比例 ， 使連接產物增多 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 28 （ 3）避免 外源 DNA片段之間的連接 措施 ? 在基因組 文庫的構建過程中， 最應引起重視的問題是：嚴禁外源 DNA片段之間的連接?。。? ? 為了避免上述情況的發(fā)生， 可采取下列措施的組合： ? 將待連接的 DNA片段根據載體的裝載量 分級分離 ? 用堿性磷酸單酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基團 ? 用酶在 DNA片段的末端上增補同聚尾末端 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 29 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 30 重組 DNA導入宿主及篩選 ? 轉化 ? 轉導 ? 轉染 ? 感染 ? 結合 ? 其它 2022/2/12 31 密集鋪板（ 110萬） ? 雜交 ? 挖取 目的重組克隆 ? 鋪板 ? 鋪板 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 32 構建噬菌體基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 33 用粘粒載體建立基因組文庫的主要步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 34 基因組文庫重組克隆的排序 ? 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構建在技術上并不十分困難，如果一個 YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調出任何一段 DNA序列。 ? 然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一個像天然染色體 DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作量可能遠大于基因組文庫的構建，屬于基因文庫的后期制作 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 35 （ 1）酶切片段末端標記法 ? 將單一的 YAC克隆插入 DNA片段用限制性內切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標記同位素。 ? 然后再用 Sau3A I或 Mbo I將末端標記的 DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每 10個 YAC克隆走在同一塊板上，形成 10個克隆的特征性 DNA指紋圖譜 ? 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆 DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個 YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個YAC克隆的 DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 36 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 單一克隆指紋圖譜 十克隆指紋圖譜 載體 DNA 克隆 DNA 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 37 （ 2）隨機探針聯(lián)合雜交法 ? 將若干 YAC克隆固定在薄膜上，并復制二十份薄膜；合成 20種不同序列的短探針，其序列是隨機的。 ? 用 20種探針隨機定位雜交（一對一） 20份 YAC克隆薄膜。 ? 如果某兩個克隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應，則這兩個克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結果記為“ 1” ，而陰性結果記為“ 0” ，可清晰地列成一張表，最終排出上述 YAC克隆的排列順序 。 2022/2/12 38 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2022/2/12 39 01 04 12 06 13 14 02 17 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 2022/2/12 40 （ 3）染色體走讀法（ chromosome walking） ? 從基因文庫中任取一個克隆作為染色體走讀的起點，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在 ~ kb范圍內 ? 分別以上述亞克隆 DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入 DNA片段必定與起點克隆所含的 DNA片段連鎖在一起 ? 然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進行第二步走讀，直至線型染色體 DNA的端點 2022/2/12 41 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點克隆片段 亞克隆旁測序列 探針標記 第一輪雜交 陽性克隆 陽性克隆 第二輪雜交 第二輪雜交 2022/2/12 42 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點克隆片段 2022/2/12 43 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 構建了基因文庫僅僅是完成了基因克隆，并不等于完成了基因分離。構建成的文庫僅是一個雜亂無章的“基因圖書館”，要想從中找到所需基因，必須有一些相關線索。分離目的基因也要知道與目的基因有關的某些或某個特征，才能據此找到相關基因。主要方法有： ?核酸雜交方法； ?免疫學檢測方法； ?DNA同胞選擇法（極少用）； ?PCR篩選法； ?其他方法。 2022/2/12 44 （ 1）核酸雜交方法 ? 適用于大量篩選，常用，可靠。但需制備探針，所用探針有多種，獲得探針的方法很多； （ 2）免疫學檢測方法 （ 3） DNA同胞選擇法（極少用） 使用抗體探針，通過檢測重組克隆表達出的蛋白質來篩選目的克隆。只適用于表達文庫的篩選，并只能篩選出表達了的克隆。 DNA同胞選擇法是按矩陣分值亞庫，用 mRNA與 cDNA雜交后釋放出 mRNA ，使其在無細胞蛋白合成體系中翻譯，并對翻譯產物進行免疫沉淀、 PAGE電影鑒定或活性分析等來篩選目的快樂，該方法要求全長 cDNA，一般只在無其他方法可用或表達產物很小時才用 2022/2/12 45 （ 4） PCR篩選法 ? 其顯著特點是快速、簡便。該方法的基本策略是采用“反應池” ，將基因文庫分裝 96孔培養(yǎng)板，如有 2304個克隆分別置于 24個 96孔培養(yǎng)板中，現(xiàn)以反應板為單位，將 96個克隆混合成一個“反應池”，進行一個 PCR反應，如圖： 2022/2/12 46 ? 從 24個反應板中找出具 有陽性克隆 的反應板，再將該板中的 12個橫向克隆與 8個縱向克隆分別混合，形成 12個橫向池及 8個縱向池，進行 20個（ 8+12）反應，如圖，橫向陽性池與縱向陽性池交叉的孔為陽性單克隆，通過44個反應可從 2304個克隆中篩選分離出單個克隆。 2022/2/12 47 大腸桿菌作為寄主進行 DNA克隆的實驗方案 DNA片段 的獲得 載體構建 細菌轉化 重組體 的鑒定 限制性內 切酶消化 機械切割 雙鏈 cDNA 的合成 化學法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 連接 平末端 連接 加接頭造成 粘性末端 重組噬菌體 DNA轉染 重組質粒 的轉化 體外包裝 進行轉導 表型鑒定 核酸雜交 免疫學分析 酶切鑒定 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 48 ? 圖克隆策略的一般總結，箭頭顯示了最佳路線。 注意，在以細胞為基礎的克隆策略中，DNA最初是由非特異性的方法并克隆的，因此在結尾步驟需要篩選出目標克隆。相反地，當特異性的 DNA片段是通過 PCR或直接化學合成的方式獲得的時候，也就不需要后續(xù)的篩選了。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 49 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? 通過 PCR直接擴增出目的基因 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 50 3 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? cDNA文庫的構建 ? cDNA克隆的操作流程 2022/2/12 51 . cDNA 以 mRNA為模板 逆轉錄 出的 DNA稱 cDNA。 . cDNA library mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉錄酶 引物 利用某種生物的 總 mRNA合成 cDNA，再將這些 cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱 cDNA文庫。 cDNA文庫的構建 2022/2/12 52 （ 1） 不含內含子序列 。 （ 2）可以在細菌中直接表達。 （ 3）包含了所有 編碼蛋白質的基因 。 （ 4）比 DNA文庫小 的多，容易構建。 . 構建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1）總 RNA（ total RNA）提取