向內(nèi)皮細胞分化的骨髓間充質(zhì)干細胞體外三維構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實驗研究-文庫吧
2024-12-31 01:59 本頁面
【正文】 (晶美生物工程北京有限公司),內(nèi)皮素(ET1)放射免疫藥盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫所),纖維連接蛋白(Fibronectin,Fn),內(nèi)皮細胞生長因子(ECGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(美國Sigma公司)。 MSCs的分離 無菌下在綿羊髂前上棘處行骨髓穿刺，抽出10 mL左右骨髓，以DMEM液稀釋1～2倍后，1 500 r/min離心10 min，棄含有脂肪及血小板的上清，再以等量的DMEM液重懸血細胞,沿管壁緩慢加入含10 g/mL的Percoll梯度離心液的離心管內(nèi),用水平離心機以2 000 r/min離心30 min，吸取上中層之間的乳白色單個細胞層移入另一離心管中，并以5倍的DMEM液稀釋混勻后，2 000 r/min離心10 min，棄上清，加入少量的DMEM液制成細胞懸液，獲取MSCs懸液。 MSCECs培養(yǎng)及體外擴增 將上述獲取的MSCs懸液以2105 cm2底面積接種于培養(yǎng)瓶中,加入內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM液，VEGF 10 ng/mL，ECGF 10 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，肝素50 IU/mL),、37 ℃的CO2飽和濕度恒溫孵箱中培養(yǎng)，48 h后換液，以后每3天換液1次，當(dāng)細胞達到80%～90%% Trypsin+% EDTA消化傳代，取第2代細胞進行鑒定，第4代以后用于研究構(gòu)建TEHV。 MSCECs的表型鑒定及細胞功能測定 將第2代MSCECs以每孔2105接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，加入培養(yǎng)液1 mL，24 h后取出蓋玻片,PBS液沖洗，甲醇固定20 min，常規(guī)免疫組化方法，加入ΑSMA抗體、Vimentin抗體、CD31抗體、Ⅷ因子抗體，采用EnVision二步法染色。上述細胞培養(yǎng)上清液置入70 ℃中保存，以備測定其分泌的NO及ET1水平，測定方法參照藥盒說明書操作。 MSCECs生長曲線測定 取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，消化制備單細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為每孔5l03，接種于96孔培養(yǎng)板，每個時相細胞接種3孔，每孔200 ΜL細胞懸液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從第2天起，連續(xù)9 d,每天固定時間取3孔，% Trypsin+% EDTA消化后置于顯微鏡下計數(shù)，以時間為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。 MSCECs的超微結(jié)構(gòu)研究 取75 cm75 cm培養(yǎng)瓶中90%融合的MSCECs，PBS漂洗，% Trypsin+% EDTA消化，離心后4%多聚甲醛固定送透射電鏡檢測。 瓣膜支架的制備及預(yù)處理 將新鮮無菌豬主動脈瓣(含部分升主動脈及瓣下組織)% Trypsin+% EDTA液中于37 ℃下持續(xù)振蕩24 h，PBS液反復(fù)振蕩沖洗殘余胰酶后制備去細胞豬主動脈瓣支架,取一支架行HE染色及彈力纖維及膠原纖維染色(VB染色)研究去細胞效果及彈力纖維，膠原纖維的完整性。制備的其余支架置入液氮中保存?zhèn)溆?。本研究中支架?50 Μg/mL的Fn溶液完
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