分子生物學(xué)課件第01章細(xì)胞核基因組-文庫吧
2024-12-29 08:04 本頁面
【正文】 ， 在一定的范圍內(nèi) ， 一價(jià)陽離子濃度每增加 10倍 ， Tm增加℃ 。 若要降低 Tm， 可加入甲酰胺 ， 因?yàn)榧柞０纺芙档蜌滏I的穩(wěn)定性 。 復(fù)性與雜交 在適宜的條件下 ， 兩條分開的互補(bǔ)鏈可重新形成雙螺旋 ， 這個(gè)反應(yīng)稱為復(fù)性 （ renaturation） 。使兩條互補(bǔ)的單鏈形成雙螺旋的過程稱為退火（ anneal） 。 兩條不同來源的互補(bǔ)單鏈經(jīng)退火形成雙鏈的反應(yīng)稱為雜交 （ hybridization） ， 雜交可以在 DNA單鏈之間進(jìn)行 ， 也可以在 DNA單鏈和RNA單鏈之間進(jìn)行 。 復(fù)性動(dòng)力學(xué) 復(fù)性動(dòng)力學(xué)指的是復(fù)性核酸的量隨著時(shí)間變化的情況 。 它可以用來檢測 DNA的復(fù)雜性 。 高度重復(fù)序列多則復(fù)雜性低 ， 單一序列多則復(fù)雜性高 。 復(fù)性動(dòng)力學(xué)的測定 首先將純化的 DNA通過高速攪拌或小孔噴射 ， 以取得大小均勻的片段； 100℃ 瞬間處理后 （ 使其變性 ） 迅速冷卻到適當(dāng)溫度復(fù)性 ， 如溫度控制在低于 Tm 20℃ 左右 ， 在標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖液中保溫 ， 每隔一定時(shí)間測定 DNA復(fù)性的數(shù)量 。 復(fù)性動(dòng)力學(xué)的測定 測 DNA復(fù)性的方法有兩種 ， 一種是測 A260的變化 ， 另一種是用羥基磷灰石柱分離雙鏈和單鏈 DNA， 雙鏈 DNA吸附而單鏈 DNA流出 ，再測定流出單鏈 DNA的量 。 復(fù)性動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo) DNA復(fù)性取決于兩條單鏈的隨機(jī)碰撞 ， 因此它遵循二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué) ， 其反應(yīng)符合下列方程式： 式中 C為時(shí)間 t時(shí) ， 單鏈 DNA的濃度； k為反應(yīng)速度常數(shù) 。 2kCdtdC ?? k d tdCC ??21001ttCCktC???? ? ??CCtt k dtdCC0 021 ， ， （ 2） 0011 tktkCC ?????， ∵ ， 00 ?t∴ 011CktC ??00 11CtkCC??1100 ?? tkCCC， ………… （ 1） 當(dāng)復(fù)性完成一半時(shí) ， ， 帶入 （ 1） 式得 21,021 ?? CCtt1121210 ??tkC 12 210 ?? tkC 1210 ?tkC ktC1210 ?， ， … 復(fù)性動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo) 復(fù)性動(dòng)力學(xué)方程的意義 從 （ 1） 式和 （ 2） 式可以看出 ， 控制復(fù)性反應(yīng)的參數(shù)是單鏈 DNA初始濃度 和復(fù)性時(shí)間 的乘積 ， 稱為 。 越大 ， 越小 。 0C ttC0 k210tC1100 ?? tkCCC………… （ 1） （ 2） ktC1210 ?………… 簡單基因組的 Co t曲線 橫坐標(biāo) C 0 t C0t1/2值與基因組大小的比例關(guān)系 可以作為衡量一個(gè)基因組大小的尺度 ， 但必須注意前提條件 （ 非重復(fù)序列 ） 。 210tC真核生物基因組的單一序列和重復(fù)序列 當(dāng)基因組中存在有重復(fù)序列時(shí) ， 情況就復(fù)雜了 。 由于重復(fù)序列相互碰撞的幾率較高 ， 復(fù)性速率也就較快 。 既有單一序列又有重復(fù)序列的基因組的 曲線會(huì)出現(xiàn)若干個(gè)拐點(diǎn) 。 tC0假設(shè)的真核基因組的 Cot曲線 三個(gè)部分的表觀 分別為 、 630，分別占基因組的百分?jǐn)?shù)為 25%、 30%和 45%。 210tC高度重復(fù)序列 中度重復(fù)序列 單一序列 重復(fù)序列單位長度的計(jì)算 為了推算每一部分 DNA所對(duì)應(yīng)的 bp數(shù) ， 必須把每一部分當(dāng)成獨(dú)立的組成來考慮 。 三個(gè)部分的實(shí)際 應(yīng)為 25% = ， 30% = ，630 45% = 283。 以大腸桿菌的 = ，則三個(gè)部分的 bp數(shù)應(yīng)為 （ 視作單一序列 ） ： 210tC210tC 6 ??? 56 ???? 86 ????重復(fù)頻率的計(jì)算 以上三個(gè)結(jié)果為動(dòng)力學(xué)復(fù)雜長度 。 此模式基因組的復(fù)雜度記為 “ 108＋ 105＋ 340 bp”
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