溶菌酶的作用機(jī)制(4)-文庫吧
2024-12-24 02:15 本頁面
【正文】 位： EF鍵 。 胞壁多糖是一個 NAM和NAG交替的高聚物 ， 從而 NAM不能占據(jù)部位 C時也就不能占據(jù)部位 E。 細(xì)菌的細(xì)胞壁多糖恰好具有 NAMNAG鍵 ， 所以水解部位只能發(fā)生在 DE之間 。 用 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法研究了競爭性抑制劑 （ NAG） 3僅僅占據(jù)了大約半個裂縫 。 從活性部位的幾何大小看出酶的最小底物應(yīng)該是 （ NAG） 6。 實(shí)驗(yàn)中用 （ NAG） 6為底物 ， 確實(shí)能被酶迅速水解 。 酶活性部位剛好能容納一個六糖分子 ， A、 B、 C、 D、 E、F表示 6個糖殘基的位置 ， 只是第 4個糖殘基D環(huán)因空間的原因必須由正常的椅式變形為能量較高的半椅式或 “ 沙發(fā) ” 構(gòu)造 。 因此糖苷鍵的穩(wěn)定性減低 ， 鍵就容易從這里斷裂 。 進(jìn)一步的問題是酶的催化作用，究竟鍵是在糖苷鍵原子的哪一側(cè)被裂解的？ 回答這個問題可以在 H218O溶液中酶促水解底物 （ NAG） 6， 發(fā)現(xiàn)只有 D糖 C1上含有 18O， 而 E糖的 C4羥基只含普通的 O，由此可知這個鍵斷裂在 D糖基的 C1和 E殘基的糖苷鍵的 O之間 。 分析 DE鍵周圍的微環(huán)境 ， 最活潑的基團(tuán)顯然是 Asp52和Glu35， 它們分別位于糖苷鍵兩側(cè) 。Asp52位于糖苷鍵的一側(cè) ， 而 Glu35在另一側(cè) 。 這兩個酸性側(cè)鏈具有明顯不同的微環(huán)境 。 Asp52是在一個明顯的極性環(huán)境中 ， 在那里它在一個復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)中起著氫鍵受體的作用 。 相反 ， Glu35位于非極性區(qū) 。 這樣 ，在 pH5下 ， 這是溶菌酶水解幾丁質(zhì)的最適 pH， 即溶菌酶活性最大 。Asp52側(cè)鏈羧基為解離的 COO形式 ，而 Glu35 則 為 質(zhì) 子 化 未 電 離 的COOH形式 。 側(cè)鏈基團(tuán)的氧原子與這個糖苷鍵的距離大約是 。 Phillips等人根據(jù)上述研究資料提出溶菌酶的催化作用機(jī)制，要點(diǎn)如下： （ 1） Glu35的 — COOH提供一個 H+到 D環(huán)和 E環(huán)間的糖苷鍵 O原子上 。 H+的轉(zhuǎn)移使 D環(huán)的 C1鍵與糖苷鍵 O原子間的鍵斷開 ， 并形成正 C離子過渡態(tài)中間產(chǎn)物 。 （ 2） 含有 E及 F殘基的 NAG二聚體離開酶分子 。 （ 3） 正碳離子中間產(chǎn)物進(jìn)一步與來自溶劑的 OH發(fā)生反應(yīng) 。 Glu35質(zhì)子化 ， 由A、 B、 C和 D殘基組成的 NAG四聚體通過擴(kuò)散離開酶分子 ， 然后溶菌酶為新一輪催化過程做好了準(zhǔn)備 。 上述的催化機(jī)制中 ， 關(guān)鍵要素為： （ 1） 廣義的酸催化 ， Glu35以酸的形式提供質(zhì)子 ， 他的糖苷鍵氧原子的距離為 ， 正式合適的作用距離 。 （ 2） 正碳離子中間產(chǎn)物的形成與穩(wěn)定 ， 一方面由于 Asp52帶有負(fù)電荷的羧酸基通過靜電相互作用穩(wěn)定 D環(huán)中 C1的正電荷；另一方面由于 D環(huán)的形變 ， 由椅式構(gòu)象變?yōu)榘胍问?， 使 D環(huán)上 C CC5和 O都在一個平面上 ， 氧原子的負(fù)電性可以使正碳離子穩(wěn)定 。 因此可以說 ，在結(jié)合底物時 ， 酶迫使底物采取了接近于過渡態(tài)的構(gòu)象 。 隨著 DNA技術(shù)的新技術(shù)的發(fā)展，使以前被分解的基因的任何多肽的中間缺失、添加或替換成為了可能。通過定點(diǎn)誘變技術(shù)的使用， DNA的核苷酸序列可以特殊地變更以至多肽的氨基酸可以被任何調(diào)查者選擇的氨基酸代替。蛋白質(zhì)中的任何氨基酸可以被替代，并且調(diào)查者能確定所有蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生的持續(xù)的變更。 最早把定點(diǎn)誘變使用到溶菌酶研究的在 1989年被發(fā)表。在論文中， Asp52和 Glu35都被作為對象研究，研究是測試那些氨基酸殘余被代替的突變蛋白質(zhì)的活性。像先前研究的預(yù)期結(jié)果一樣，這些突變蛋白質(zhì)只有很少甚至沒有催化活性。 Phillips根據(jù)晶體學(xué)研究提出的底物結(jié)合方式和催化作用機(jī)制 ， 曾在各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)中受到檢驗(yàn) 。 所
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