【正文】 酶 三、限制性內(nèi)切酶的命名 EcoR I Escherichia 屬名 Coli 種名 Ry13 株系 編號(hào) 若種名頭 2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母 。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 四、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （一）識(shí)別序列 識(shí)別順序的堿基數(shù)一般為 46 bp，少數(shù)識(shí)別更長(zhǎng)，多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性 （回文結(jié)構(gòu)）， 少數(shù)的識(shí)別位點(diǎn)在切割位點(diǎn)之外，具旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性 4bp HpaⅠ C ? CGG HaeⅢ GG ? CC 5bp AvaⅡ G? GWCC EcoRⅡ ? CCWGG 6bp BamHⅠ G ?GATTC SmaⅠ CCC ? GGG 11bp Bg1Ⅰ GCCNNNN ?NGGC 12bp BstXⅠ CCANNNNN ?NTGC N=A, T, G, C 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 四、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （二）切割方式 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈 DNA，水解磷酸二酯鍵中 3‘位酯鍵產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是 5’P和 3’OH，產(chǎn)生3種不同的切口。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 1. 5’突出的末端 EcoRI等產(chǎn)生的 5‘ 粘性末端 5‘…G CTGAATTCGAG … 3’ 3‘…C GACTTAAGCTC … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘…G CTGOH PAATTCGAG … 3’ 3‘…C GACTTAA— P OHGCTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘…G CTGAATTCGAG … 3’ 3‘…C GACTTAAGCTC … 5’ 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 2. 3’突出的末端 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 PstI等產(chǎn)生的 3‘ 粘性末端 5‘… CTGCAG… 3’ 3‘… GACGTC … 5’ PstI 37 ℃ 5‘… CTGCAOH PG … 3’ 3‘… G P OH ACGTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘… CTGCAG… 3’ 3‘… GACGTC … 5’ 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 粘性末端的意義 ①連接便利 i）不同的 DNA雙鏈： 只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。 這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 ii）同一個(gè) DNA分子內(nèi)連接： 通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。 ② 5’末端標(biāo)記 凸出的 5’末端可用 DNA多核苷酸激酶進(jìn)行 32P標(biāo)記。 凸出的 3’端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 補(bǔ)平成平齊末端 粘性末端可以用 DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 3. 平頭末端 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 PvuII等產(chǎn)生的平頭末端 5‘…G CTCAGCTGGAG … 3’ 3‘…C GAGTCGACCTC … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘…G CTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3‘…C GAGTCP OHGACCTC … 5’ 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 四、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （二）切割方式 同裂酶（ isoschizomers）： 指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生不同或相同的末端。 同尾酶（ isocaudamer）： 指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大 (相容性末端 )。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 同尾酶舉例： 如： BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 常用的限制酶 BamHⅠ 、 BclⅠ 、 BglⅡ 、 Sau3AⅠ 和 XhoⅡ 就是一組 同尾酶，它們切割 DNA之后都形成由 GATC 4個(gè)核苷酸組成的粘性末端 。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 1 U 核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫 1小時(shí)，使 1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用 U表示。 大部分 II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件： TrisHCl 50mmol/L MgCl2 10mmol/L NaCl 0150mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20100μL Temperature 37℃ Time （ DDT：二硫蘇糖醇 BSA：牛血清蛋白 ) 0 50 mM 低鹽酶 100 mM 中鹽酶 150 mM 高鹽酶 Buffer 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 在滅菌的 : 20μl體積反應(yīng)體系如下 ： DNA 10 酶切 buffer μl 限制性內(nèi)切酶 12 U（單位） 加 ddH2O 至 20 μl 多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 酶切反應(yīng)的終止 EDTA（終濃度 10mmol/L)或 SDS [終濃度 %(W/V)] 65 oC溫育 20min 酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀 酶解結(jié)果鑒定 瓊脂糖電泳 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 完全消化 ：內(nèi)切酶在 DNA上的 所有 識(shí)別位點(diǎn)都被切開。 局部消化 ：只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。 通過(guò)縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 酶切的注意事項(xiàng) : 1. 購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶多保存于 50%甘油中，于 20℃ 是穩(wěn)定的。 進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻， 再?gòu)? 20℃ 冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更換一個(gè)無(wú)菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回 20℃ 冰箱。 2. 盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制 。