【正文】 物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物 —— 照 “ 1. 空白溶劑試驗(yàn) ” 項(xiàng)下方法操作 考察目標(biāo) —— 方法的 線性范圍 、 精密度與準(zhǔn)確度 、 靈敏度 藥物的 萃取回收率 等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo) —— 同時(shí) 進(jìn)一步 檢驗(yàn)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對(duì)測(cè)定的干擾程度 ， 即 方法特異性 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 21 色譜分析法 —— 進(jìn)一步考察待測(cè)藥物 (或內(nèi)標(biāo)物 )與內(nèi)源性物質(zhì) (或其它藥物 )的分離情況 —— 色譜峰的 tR、 n 和 T 是否與水溶液的 一致 色譜峰是否為 單一成分 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著 偏離零點(diǎn) 等 —— 內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 22 4. 實(shí)際生物樣品的測(cè)試 空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗(yàn) —— 確定的分析方法及其條件 —— 不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測(cè)定 —— 藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合 (如 血漿蛋白結(jié)合物 ) 或代謝生成數(shù)個(gè) 代謝產(chǎn)物 及其進(jìn)一步的 結(jié)合物 (或綴合物 ) 實(shí)際生物樣品 —— 確立分析方法后 ， 尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)試 考察目標(biāo) —— 代謝產(chǎn)物 對(duì)藥物 、 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的 干擾 情況 —— 進(jìn)一步 驗(yàn)證方法的可行性 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 23 第三節(jié) 分析方法 驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 用于實(shí)際生物樣品分析之前 —— 驗(yàn)證 (validation) 分析方法的 可行性 與 可靠性 方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮影響分析方法 —— 所有可變因素 (采樣 ,樣品制備 ,色譜分離 ,檢測(cè)與數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)等 ) 使用的 技術(shù)指標(biāo) —— 效能指標(biāo) 使用的 樣品 —— 通常采用 模擬生物樣品 和用藥后的 實(shí)際生物樣品 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 24 驗(yàn)證步驟 首先為 分析方法 的驗(yàn)證 —— 特異性 、 精密度與準(zhǔn)確度 、 回收率 定量限與檢測(cè)限 、 溶液穩(wěn)定性 其次為 生物基質(zhì)中 待測(cè)藥物 穩(wěn)定性 的驗(yàn)證 —— 室溫放置 、 冷凍 （ 或冷藏 ） 、 凍 融循環(huán) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 25 驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求 1． 特異性 —— 避免干擾 2． 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 —— 覆蓋所有濃度范圍 3． 準(zhǔn)確度 —— 與實(shí)際狀況相符 4． 精密度 —— 結(jié)果可重現(xiàn) 5． 定量限 —— 達(dá)到峰濃度的 1/10～ 1/20 6． 穩(wěn)定性 —— 確保所有樣品準(zhǔn)確測(cè)定 7． 提取回收率 —— 確保準(zhǔn)確度 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 26 一、方法特異性 (專屬性或選擇性 ) 方法的特異性 (specificity) —— 又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?， 通常與選擇性 (selectivity)互用 —— 系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí) ， 方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力 專屬性 —— 表示所檢測(cè)的 信號(hào) (響應(yīng) )系屬于 待測(cè)藥物所特有 的 選擇性 —— 系指將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以 區(qū)分 (分離 )的能力 特異性 —— 函蓋二者 ， 以 驗(yàn)證 所測(cè)定的物質(zhì)與待測(cè)藥物的 同一性 考察一個(gè)分析方法是否具有特異性 ， 應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)： 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 27 1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 比較 —— 待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào) 對(duì)照品 （ 或標(biāo)準(zhǔn)品 ） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品 （ 空白生物基質(zhì)中添加對(duì)照品 ） —— 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 是否一致 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的 R 確證 —— 內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 28 2. 代謝產(chǎn)物的干擾 比較 —— 模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào) 與代謝產(chǎn)物 (在實(shí)際樣品中 tR 隨 時(shí)間延長(zhǎng)而增加 )的 R 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 〔 或改變色譜條件 (色譜柱 )再比較 〕 確證 —— 其它代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾 結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測(cè)定 —— 必要時(shí)通過(guò) HPLCDAD和 LCMS確證色譜峰的單純性和同一性 對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定 —— 可采用 LCLCNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后 ， 考察其干擾情況 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 29 3. 伍用藥物的干擾 TDM 時(shí) —— 還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物 (通常為數(shù)有限 )的干擾 比較 —— 待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生物樣品的 檢測(cè)信號(hào) —— 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 是否一致 確證 —— 同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的 干擾情況 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 30 4. 與參比方法的相關(guān)性 除上述方法外 ， 有時(shí)還可使用參比方法對(duì)照 參比方法 一般選用特異性強(qiáng) 、 準(zhǔn)確度高 、 線性關(guān)系良好的色譜法 —— 如在 TDM中使用 UV(或 RIA)時(shí) , 可以 HPLC(或 GC)為參比 參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo) (X)。 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo) (Y) 用最小二乘法計(jì)算回歸方程 Y＝ a＋ bX (坐標(biāo)標(biāo)度相等 ) 相關(guān)系數(shù) (r)——表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 —— 若 r ≠1， 表示擬定方法為非線性 ， 如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 31 4. 與參比方法的相關(guān)性 Y＝ a＋ bX 截距 (a) —— 表示擬定方法受到 恒定干擾 的程度 —— 內(nèi)源性物質(zhì) (UV) 斜率 (b) —— 表示擬定方法受到 比例干擾 的程度 —— 標(biāo)記抗原不純 (RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較 —— 除顯示分析方法的特異性外 —— 斜率 b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 若參比方法準(zhǔn)確度良好 —— 若截距 a≈0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度 (回收率 )為 100b(%) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 32 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線 （ standard curve） —— calibration curve or working curve —— 生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的 相關(guān)性 （ 比例的程度 ） —— 通常用回歸分析方法所得的 回歸方程 來(lái)評(píng)價(jià) —— 除少數(shù)方法 （ 免疫分析法 ） 外 ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為 線性模式 —— 回歸分析法為 最小二乘法 （ least squares） 或 加權(quán)最小二乘法 （ weighted least squares） 線性范圍 （ linear rang） —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 —— 模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 33 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 (續(xù) ) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 —— 用 模擬生物樣品 建立 —— 線性范圍 (不包括零點(diǎn) )應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 —— 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品 —— 應(yīng)使用與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 34 標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 (非生物基質(zhì)溶液 )的制備 溶劑 —— 水或甲醇 （ 或其他適當(dāng)溶劑 ） 濃度 —— 標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品中藥物濃度的 50倍以上 加入量為生物樣品總體積的 2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實(shí)際樣品存在較大差異 濃度較低 —— 應(yīng) 除去溶劑 后再加入生物基質(zhì) 否則 ,在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 35 2. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍 至少含 5～ 8個(gè)濃度點(diǎn) (不包括零點(diǎn) ,即空白 ) —— 可 覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃度 如： 50、 100(等比梯度模式 — 比例常數(shù)約為 2) 若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為 50， 其 1/20為 設(shè)定最高濃度為 100， 最低濃度為 1 (個(gè)體差異 ) 實(shí)際制備時(shí)： 500、 250、 100、 50、 10 …… 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 36 3. 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備