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云南師范大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練基金項(xiàng)目中期檢查報(bào)告書【最新】-文庫(kù)吧

2025-08-10 21:41 本頁(yè)面


【正文】 察染色體的真正可用材料 (李懋學(xué), 1991; 周云龍 , 2020; 楊繼 , 2020) 。 A 種子根 做實(shí)驗(yàn)需要需要進(jìn)行種子培養(yǎng)才能得到我們需要的材料。 B 種子培養(yǎng) 為滿足種子萌發(fā)所需條件,根據(jù)種子的大小,萌發(fā)所需時(shí)間和性質(zhì),可分別采用不同的基質(zhì)培養(yǎng)根尖。 a 濾紙培養(yǎng)法 :小 種子(毫米數(shù)量級(jí)以下),萌發(fā)快且不易腐爛。對(duì)太小的種子換水不方便。 b 紗布培養(yǎng)法 :小至大種子,萌發(fā)較 快且不易腐爛, 方便換水。 c 蛭石、鋸末或沙土培養(yǎng)法 :用于較大且易于腐爛的種子。好處是不用像 濾紙、水培那樣經(jīng)常換水。 d 水培法 :用于大型種子。方法是將泡沫塑料板挖孔并漂浮于水中,將種子置于孔中并使種孔接觸水面。該方法很好地解決水氣矛盾,且培養(yǎng)的根尖潔凈利于壓片操作。 e 試管培養(yǎng)法 :此法操作繁復(fù)而很少用,一般僅用于材料難得的珍貴植物。種子或其他材料要經(jīng)消毒( 尤瑞麟, 2020)。 正常栽培植株根 a 季 節(jié)性強(qiáng),一般只能在春季和夏季進(jìn)行; b 生長(zhǎng)狀態(tài)一般要求植株生長(zhǎng)健壯。 ( 2) 莖尖 所用分生組織為生長(zhǎng)錐和葉原基 (李懋學(xué),張敦芳等 , 1991)。 自然生長(zhǎng)的植物,季節(jié)性較強(qiáng)。多年生落葉植物,包括木本和草本,一般是每年春天直至夏天,植物開始萌動(dòng)一段時(shí)間以后,取材最為適宜。此時(shí)植物生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),分生組織細(xì)胞分 7 裂旺盛。常綠植物也同樣有季節(jié)性,表現(xiàn)為干濕季,取材應(yīng)在雨季。 此外根據(jù)不同的植物,還有居間分生組織、莖的形成層、花蕾、花粉等也可以用于染色體制片分析。對(duì)于有些植物花蕾中發(fā)育中的花藥比根尖效果 還好 ( 3) 我們采用的一般方法 濾紙培養(yǎng)法 :挑選出沒(méi)發(fā)霉估 計(jì)能正常發(fā)芽的種子數(shù)粒,置于一洗干凈并放有才剪好的干凈濾紙的培養(yǎng)皿中,種子之間須有距離以免交叉感染。一般每個(gè)培養(yǎng)皿放入十粒左右種子(具體數(shù)目依種子大小判定),然后均勻撒上少量水,水的量原則上在能保持種子濕潤(rùn)即可,因此在種子培養(yǎng)期間需要每天或隔天許多次到實(shí)驗(yàn)室給培養(yǎng)皿加水。將培養(yǎng)皿蓋好放入很穩(wěn)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基的溫度需保持在 2226 ℃ (通常置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)) 。 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的探索和從師兄師姐那里得到的經(jīng)驗(yàn),我們總結(jié)出以下幾種種子萌發(fā)的培養(yǎng)方法: 由于 我們做實(shí)驗(yàn)的種子 較少 ,因此在開始測(cè)定種子發(fā)芽時(shí)間的前幾次培養(yǎng)加入種子的量應(yīng)比較少,三至五顆即可,同時(shí)開始幾次發(fā)芽種子少在做取材時(shí)間等梯度試驗(yàn)時(shí)能減少種子浪費(fèi);不同的種子有不同的特性,因此種子萌發(fā)時(shí)間各有不同,不能按經(jīng)驗(yàn)計(jì)算,需每天多次觀察種子發(fā)芽時(shí)間;有些種子培養(yǎng)需做特殊處理,如豆科 (如: 冬麻豆、 膀胱豆、黃花木、銀合歡) 等種子有較硬的外殼包裹,水分等條件難以刺激其發(fā)芽或發(fā)芽較慢,我們可以用砂紙將其中皮擦薄或用小刀等物小心的將其堅(jiān)硬的外殼割掉一小點(diǎn),但注意不能傷到種子的胚 (如銀合歡) ;一些種子難以發(fā)芽,需觀察 其原因,如果是培養(yǎng)了幾天一顆都沒(méi)發(fā)或發(fā)芽的種子非常少但種子沒(méi)有發(fā)軟或發(fā)脹,那說(shuō)明這種培養(yǎng)方式很難引起其發(fā)芽需換一種方式或加其他條件,如在陽(yáng)光下刺激、 4176。 C 低溫處理(如 : 唇形科綿參 )、 在室溫下培養(yǎng)、調(diào)整溫度等;如果是幾天后發(fā)覺大量種子發(fā)霉或發(fā)軟并不能發(fā)芽,那說(shuō)明種子上有大量細(xì)菌 , 需進(jìn)行清洗或大概的滅菌,或種子有蟲時(shí)就得及時(shí)在種子袋中把幼蟲的種子拿出扔掉,并從新培養(yǎng)。 預(yù)處理 目的:中期分裂相的細(xì)胞比例高;染色體高度濃縮,形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。 原理:某些化學(xué)試劑能夠阻止或破壞紡錘體微 管的形成并導(dǎo)致染色體濃縮 (劉永安、馮海生等, 2020) 。 預(yù)處理化學(xué)藥品 : A. 秋水仙素( Colchicine) 一種生物堿,分子式為 C22H25NO6。純品為針狀結(jié)晶,商品為白色或淡黃色粉末。易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛,但在熱水中的溶解度較差,不易溶于苯和乙醚。秋水仙素性極毒,能引起眼睛暫時(shí)失明和使中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻醉而導(dǎo)致呼吸困難。因此使用時(shí)應(yīng)特別注意安全。 有效濃度范圍為 %— 1%;通常用的濃度范圍為 %— %。 配制簡(jiǎn)單,溶于蒸餾水中即可。一般配制 %的濃度,儲(chǔ) 存于冰箱中冷藏備用,用時(shí)稀釋到所需濃度 ( 李懋學(xué),張敦芳等 , 1991) 。 B. 對(duì)二氯苯或?qū)Χ却剑?pDichlorobenzene,簡(jiǎn)稱 pDB) 一種有機(jī)化合物,分子式為 C6H2Cl2,分子量 。商品對(duì)二氯苯為無(wú)色結(jié)晶,大塊時(shí)為白色,具特殊臭味,易溶于乙醇、乙醚和苯等有機(jī)溶劑,難溶于水,易燃、有毒,通常作防腐劑。 對(duì)二氯代苯不僅對(duì)紡錘體微管的組裝有較強(qiáng)的阻抑作用,還可能對(duì)其他的微管蛋白及某些細(xì)胞器有分解作用,可極大地改變細(xì)胞質(zhì)的粘滯度,稱之為對(duì)細(xì)胞質(zhì)的清除作用。因此使染色體更易于 分散。 但是,應(yīng)該注意的是對(duì)二氯苯對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)的毒害作用較大,預(yù)處理溫度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),很容易導(dǎo)致染色體斷裂、粘連等類似輻射畸變的效應(yīng)。 配制方法:應(yīng)用飽和水溶液,配制方便。稱取 5克結(jié)晶放入棕色試劑瓶中,加入 100 ml加溫到 40— 45℃的蒸餾水,振搖 5分鐘,靜置 1小時(shí)后即可使用。溶液用完后補(bǔ) 8 充加入蒸餾水,也可用自來(lái)水配制。 C. 8羥基喹啉( 8Hydroxyquinoline) 一種有機(jī)化合物,分子式為 HOC6H3N: CHCH: CH,分子量為 。本品為白色或微紫紅色的結(jié)晶或粉末 ,溶于酒精而難溶于水。 8羥基喹啉不僅具有秋水仙素的特點(diǎn),而且所顯示的染色體縊痕和隨體結(jié)構(gòu),往往比秋水仙處理更為清晰。尤其在處理中小染色體材料時(shí),這一優(yōu)點(diǎn)更為明顯。另外,其作用較前兩種藥品緩和,一般處理時(shí)間相應(yīng)要長(zhǎng)。 配制方法:配制 ,因其難溶于水,稱量的藥品撒入水中后,加溫到 60℃數(shù)小時(shí)可完全溶解 ( 李懋學(xué),張敦芳等 , 1991) 。 D. α 溴萘(α Bromonaphthalene) 一種苯酚衍生物,分子式為 C10H7Br,分子量為 ,常溫下為無(wú)色 或淡黃色液體,易溶于乙醇和苯,微溶于水。 對(duì)微管的作用比較緩和,對(duì)染色體縮短作用緩慢,即使延長(zhǎng)時(shí)間也不易對(duì)染色體產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。 配制方法:使用飽和水溶液。 100ml蒸餾水中滴入一滴α 溴萘,充分振搖后即可使用。該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用,容易變質(zhì) (劉祖洞, 1987) 。 E. 混合藥物處理 a 對(duì)二氯苯 — α 溴萘 配制方法: 100ml對(duì)二氯苯飽和水溶液中加入一滴α 溴萘充分振搖后即可使用。 該混合液是作用力最強(qiáng)的預(yù)處理劑,作用迅速,非常適合于處理大染色體的材料,又適合于以染色體計(jì)數(shù)為目的的 預(yù)處理。當(dāng)然該試劑對(duì)細(xì)胞的毒害作用也大,造成染色體嚴(yán)重粘連,聚縮成團(tuán),一定要掌握處理時(shí)的溫度和時(shí)間。 b 秋水仙素 — 8羥基喹啉 配制方法: %— %秋水仙素與 ( 1: 1)混合使用。兩者分別配制存放,用時(shí)混合。 應(yīng)用該混合液比單獨(dú)用 8羥基喹啉效力強(qiáng),即可縮短處理時(shí)間,又保持了 8羥基喹啉使染色體縊痕清晰的特點(diǎn)。該溶液適用范圍較廣,對(duì)具各種大小染色體的材料都可應(yīng)用,因此最適合于作核型分析的目的 (劉祖洞, 1987) 。 F. 低溫處理 低溫也可以阻抑紡錘體微 管的組裝,與預(yù)處理試劑有異曲同工之效。但并不能適用于所有植物,不同植物對(duì)低溫的反應(yīng)不同。目前知道可以采用這一方法的植物不多,成功的例子主要是禾本科的農(nóng)作物,如小麥、黑麥、大麥用 1— 4℃,水稻、玉米用 6— 8℃可以獲得較好效果,但處理時(shí)間較長(zhǎng)。 處理方法 : A 離體處理 將根尖從植物體上切割下來(lái),浸入處理液中進(jìn)行前處理。 B 非離體處理 一般在植物原材料較小,如萌發(fā)的種子,而且是無(wú)土培養(yǎng),可以采用此方法。無(wú)須切割根尖,把整個(gè)種子浸泡于處理液中即可。此方法的優(yōu)點(diǎn)是根尖生長(zhǎng)未受到斷 絕營(yíng)養(yǎng)的影響,可以獲得更多中期分裂相的細(xì)胞。但很多材料無(wú)法應(yīng)用該方法,又所需處理液較多 ( 李懋學(xué),張敦芳等 , 1991) 。 處理時(shí)間 : 處理時(shí)間受下面幾個(gè)因素的影響,為其共同作用的結(jié)果。一般情況下,處理時(shí)間控制在半個(gè)工作日。 A 材料 B 染色體大小 C 處理方法 9 D 處理液濃度 E 材料大小 F 處理液溫度:多在室溫。 具體材料的處理?xiàng)l件和時(shí)間由預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索。當(dāng)然,許多植物植物都有人研究過(guò),我們?cè)谟?jì)劃實(shí)驗(yàn)之前,首先要參考別人的工作。 如果沒(méi)有,可參照近緣物種的處理?xiàng)l件和時(shí)間。 我們實(shí)驗(yàn)室一般用 8羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理, 此液在使用的過(guò)程中需避光處理,而且若試劑因配置時(shí)間長(zhǎng)了可能會(huì)變質(zhì),影響預(yù)處理效果。 預(yù)處理時(shí)間一般為 30min至 4h,不同種的預(yù)處理時(shí)間需對(duì)相近種的時(shí)間進(jìn)行參考,需對(duì)預(yù)處理時(shí)間多做幾次梯度試驗(yàn),以找到最適時(shí)間預(yù)處理時(shí)間直接影響染色體的形態(tài),因此需找到最佳時(shí)間 。 固定 固定的目的是利用化學(xué)試劑將生活細(xì)胞迅速殺死,并使構(gòu)成染色體的核蛋白變性和沉淀,以保持染色體的固有形態(tài)結(jié)構(gòu)。 固定液 : Carnoy’s (卡諾)Ⅰ:冰乙酸:無(wú)水乙醇 = 1: 3 Carnoy’s (卡諾)Ⅱ:冰乙酸:氯仿:無(wú)水乙醇 = 1: 3: 6 通常都用配方Ⅰ,且無(wú)水乙醇也可用 95%乙醇或甲醇代替。此外其比例也可改變,如材料較硬,可提高冰乙酸的比例,如一比二,甚至一比一。配方Ⅱ主要用于某些含油脂類物質(zhì)或某些需要更加硬化的組織的固定 ( 李懋學(xué),張敦芳等 , 1991) 。 固定時(shí)間一般 2— 24小時(shí),通常在低溫狀態(tài)下較好,一般在 4℃冰箱中進(jìn)行,具體時(shí)間需對(duì)相近種時(shí)間進(jìn)行參考。 解離 植物細(xì)胞外被纖維素和果膠組成的細(xì)胞壁,不經(jīng)處理其染色體無(wú)法分散開來(lái)。因此得到染色體分散良好的制片,必須先軟化和消解細(xì)胞壁 ( 李懋學(xué),張敦芳, 1991) 。 A. 鹽酸 鹽酸是消解細(xì)胞壁最常用的試劑。多用的濃度為 1mol/L,溫度為 60℃(并不嚴(yán)格),處理時(shí)間為 5— 10 分鐘。某些禾本科的根尖材料可延長(zhǎng) 20— 25 分鐘。很多材料也可以用,同樣在 60℃解離 5— 10分鐘。 B. 酶解離 蒸餾水分別配制 2%的纖維素酶和果膠酶,用時(shí)按一定比例混合(如 1: 1)。注意材料在酶解之前一定 洗凈固定液。酶解一般在 37℃溫度下進(jìn)行,解離時(shí)間要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。 我們通常用 1mol/L的 鹽酸在 60176。 C水浴鍋中解離,具體時(shí)間亦需作梯度試驗(yàn),可 對(duì)相近種時(shí)間進(jìn)行參考。 染色劑及染色方法 對(duì)染色體進(jìn)行染色,以方便直接的在鏡檢時(shí)鑒別出染色體并對(duì)其數(shù)目和核型進(jìn)行觀察和研究,因此染色的好壞是關(guān)鍵。 常用的染液有以下幾種: 洋紅( Carmine) : 從胭脂蟲提取加工而成的非結(jié)晶性染料。 配制方法 : 鐵 — 乙酸洋紅: 100ml45%冰乙酸置 200ml三角燒瓶加熱煮沸,移去火源,緩緩(切記緩緩,否則沸騰 噴濺)加入 1g洋紅粉末,攪動(dòng)溶解。待完全溶解,重置火上加熱并以細(xì)棉線懸鐵丁于溶液中保持 12 分鐘,或者加入氫氧化鐵的 50%乙酸飽和液 12 滴(不可多加,否則沉淀)。配制完成后,室溫下靜止約 12 小時(shí),過(guò)濾于棕色滴瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆?。鐵為媒染物,染色液中含有微量鐵可明顯增強(qiáng)染色體能力。 10 地衣紅 : 一種地衣中提取的紫紅色染料。 配制方法 100ml45%冰乙酸置 200ml 三角燒瓶加熱煮沸,移去火源,緩緩(切記緩緩,否則沸騰噴濺)加入 2g地衣紅粉末,攪動(dòng)溶解。此為母液,裝棕色瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆?。母液?45%冰乙酸稀釋成 1%地衣紅染色液直接用于染色。 另有一種可以省略材料解離的方法是將上述母液取 9份與 1份 1mol/L HCl混合為 A液,再將母液用 45%乙酸稀釋成 1%地衣紅( B液)。 制片時(shí),固定的材料稍加水洗,直接投入 A液,酒精燈加熱數(shù)秒,室溫放置 30分鐘,取出材料 B液染色壓片。 乙酸地衣紅染色不能在壓片前加熱烘烤,只能在壓片之后進(jìn)行,否則退色。地衣紅易溶于酒精,制片不可用酒精脫水封片 ( 尤瑞麟, 2020) 。 堿性品紅 : 堿性品紅為三苯甲烷類混合物。 1)卡寶品紅 (改良苯酚品紅) 配制方法 原液 A:稱 3g堿 性品紅溶于 100ml70%酒精(此液可無(wú)限期儲(chǔ)存,不會(huì)變質(zhì))。 原液 B:取 10ml原液 A與 90ml5%苯酚水溶液混合,置 37℃溫箱溶解 2— 4小時(shí)(此液不穩(wěn)定,限 2周之內(nèi)使用)。 原液 C:取原液 B55ml與冰乙酸、甲醛各 6ml混合均勻。 染色液:取原液 C10— 20ml,加入 90— 80ml45%乙酸和 1g山梨醇混合溶解。 該染色液配制后為淡品紅色,如果立即使用染色較淡,放置 2 周后染色能力明顯增強(qiáng),而且放置的時(shí)間越久染色效果越好。此液可在常溫下存放 2年保持穩(wěn)定不變質(zhì)。染色時(shí)采用滴染方法。注意應(yīng)用該染色液,染色的效 果與鹽酸解離有密切關(guān)系 ( 李懋學(xué),張敦芳, 1991) 。 2)孚爾根染色法 Schiff’s 試劑:溶解 100ml煮沸的無(wú)離子水中,攪動(dòng),使其充分溶解,
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