【正文】 察染色體的真正可用材料 （李懋學(xué)， 1991； 周云龍 ， 2020； 楊繼 ， 2020） 。 A 種子根 做實(shí)驗(yàn)需要需要進(jìn)行種子培養(yǎng)才能得到我們需要的材料。 B 種子培養(yǎng) 為滿足種子萌發(fā)所需條件，根據(jù)種子的大小，萌發(fā)所需時(shí)間和性質(zhì)，可分別采用不同的基質(zhì)培養(yǎng)根尖。 a 濾紙培養(yǎng)法 ：小 種子（毫米數(shù)量級(jí)以下），萌發(fā)快且不易腐爛。對(duì)太小的種子換水不方便。 b 紗布培養(yǎng)法 ：小至大種子，萌發(fā)較 快且不易腐爛， 方便換水。 c 蛭石、鋸末或沙土培養(yǎng)法 ：用于較大且易于腐爛的種子。好處是不用像 濾紙、水培那樣經(jīng)常換水。 d 水培法 ：用于大型種子。方法是將泡沫塑料板挖孔并漂浮于水中，將種子置于孔中并使種孔接觸水面。該方法很好地解決水氣矛盾，且培養(yǎng)的根尖潔凈利于壓片操作。 e 試管培養(yǎng)法 ：此法操作繁復(fù)而很少用，一般僅用于材料難得的珍貴植物。種子或其他材料要經(jīng)消毒（ 尤瑞麟， 2020）。 正常栽培植株根 a 季 節(jié)性強(qiáng)，一般只能在春季和夏季進(jìn)行； b 生長(zhǎng)狀態(tài)一般要求植株生長(zhǎng)健壯。 （ 2） 莖尖 所用分生組織為生長(zhǎng)錐和葉原基 (李懋學(xué)，張敦芳等 ， 1991)。 自然生長(zhǎng)的植物，季節(jié)性較強(qiáng)。多年生落葉植物，包括木本和草本，一般是每年春天直至夏天，植物開始萌動(dòng)一段時(shí)間以后，取材最為適宜。此時(shí)植物生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，分生組織細(xì)胞分 7 裂旺盛。常綠植物也同樣有季節(jié)性，表現(xiàn)為干濕季，取材應(yīng)在雨季。 此外根據(jù)不同的植物，還有居間分生組織、莖的形成層、花蕾、花粉等也可以用于染色體制片分析。對(duì)于有些植物花蕾中發(fā)育中的花藥比根尖效果 還好 （ 3） 我們采用的一般方法 濾紙培養(yǎng)法 ：挑選出沒(méi)發(fā)霉估 計(jì)能正常發(fā)芽的種子數(shù)粒，置于一洗干凈并放有才剪好的干凈濾紙的培養(yǎng)皿中，種子之間須有距離以免交叉感染。一般每個(gè)培養(yǎng)皿放入十粒左右種子（具體數(shù)目依種子大小判定），然后均勻撒上少量水，水的量原則上在能保持種子濕潤(rùn)即可，因此在種子培養(yǎng)期間需要每天或隔天許多次到實(shí)驗(yàn)室給培養(yǎng)皿加水。將培養(yǎng)皿蓋好放入很穩(wěn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的溫度需保持在 2226 ℃ （通常置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)） 。 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的探索和從師兄師姐那里得到的經(jīng)驗(yàn)，我們總結(jié)出以下幾種種子萌發(fā)的培養(yǎng)方法： 由于 我們做實(shí)驗(yàn)的種子 較少 ，因此在開始測(cè)定種子發(fā)芽時(shí)間的前幾次培養(yǎng)加入種子的量應(yīng)比較少，三至五顆即可，同時(shí)開始幾次發(fā)芽種子少在做取材時(shí)間等梯度試驗(yàn)時(shí)能減少種子浪費(fèi)；不同的種子有不同的特性，因此種子萌發(fā)時(shí)間各有不同，不能按經(jīng)驗(yàn)計(jì)算，需每天多次觀察種子發(fā)芽時(shí)間；有些種子培養(yǎng)需做特殊處理，如豆科 （如： 冬麻豆、 膀胱豆、黃花木、銀合歡） 等種子有較硬的外殼包裹，水分等條件難以刺激其發(fā)芽或發(fā)芽較慢，我們可以用砂紙將其中皮擦薄或用小刀等物小心的將其堅(jiān)硬的外殼割掉一小點(diǎn)，但注意不能傷到種子的胚 （如銀合歡） ；一些種子難以發(fā)芽，需觀察 其原因，如果是培養(yǎng)了幾天一顆都沒(méi)發(fā)或發(fā)芽的種子非常少但種子沒(méi)有發(fā)軟或發(fā)脹，那說(shuō)明這種培養(yǎng)方式很難引起其發(fā)芽需換一種方式或加其他條件，如在陽(yáng)光下刺激、 4176。 C 低溫處理（如 ： 唇形科綿參 ）、 在室溫下培養(yǎng)、調(diào)整溫度等；如果是幾天后發(fā)覺大量種子發(fā)霉或發(fā)軟并不能發(fā)芽，那說(shuō)明種子上有大量細(xì)菌 ， 需進(jìn)行清洗或大概的滅菌，或種子有蟲時(shí)就得及時(shí)在種子袋中把幼蟲的種子拿出扔掉，并從新培養(yǎng)。 預(yù)處理 目的：中期分裂相的細(xì)胞比例高；染色體高度濃縮，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。 原理：某些化學(xué)試劑能夠阻止或破壞紡錘體微 管的形成并導(dǎo)致染色體濃縮 （劉永安、馮海生等， 2020） 。 預(yù)處理化學(xué)藥品 ： A． 秋水仙素（ Colchicine） 一種生物堿，分子式為 C22H25NO6。純品為針狀結(jié)晶，商品為白色或淡黃色粉末。易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，但在熱水中的溶解度較差，不易溶于苯和乙醚。秋水仙素性極毒，能引起眼睛暫時(shí)失明和使中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻醉而導(dǎo)致呼吸困難。因此使用時(shí)應(yīng)特別注意安全。 有效濃度范圍為 %— 1%；通常用的濃度范圍為 %— %。 配制簡(jiǎn)單，溶于蒸餾水中即可。一般配制 %的濃度，儲(chǔ) 存于冰箱中冷藏備用，用時(shí)稀釋到所需濃度 （ 李懋學(xué)，張敦芳等 ， 1991） 。 B． 對(duì)二氯苯或?qū)Χ却剑?pDichlorobenzene，簡(jiǎn)稱 pDB） 一種有機(jī)化合物，分子式為 C6H2Cl2，分子量 。商品對(duì)二氯苯為無(wú)色結(jié)晶，大塊時(shí)為白色，具特殊臭味，易溶于乙醇、乙醚和苯等有機(jī)溶劑，難溶于水，易燃、有毒，通常作防腐劑。 對(duì)二氯代苯不僅對(duì)紡錘體微管的組裝有較強(qiáng)的阻抑作用，還可能對(duì)其他的微管蛋白及某些細(xì)胞器有分解作用，可極大地改變細(xì)胞質(zhì)的粘滯度，稱之為對(duì)細(xì)胞質(zhì)的清除作用。因此使染色體更易于 分散。 但是，應(yīng)該注意的是對(duì)二氯苯對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)的毒害作用較大，預(yù)處理溫度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，很容易導(dǎo)致染色體斷裂、粘連等類似輻射畸變的效應(yīng)。 配制方法：應(yīng)用飽和水溶液，配制方便。稱取 5克結(jié)晶放入棕色試劑瓶中，加入 100 ml加溫到 40— 45℃的蒸餾水，振搖 5分鐘，靜置 1小時(shí)后即可使用。溶液用完后補(bǔ) 8 充加入蒸餾水，也可用自來(lái)水配制。 C． 8羥基喹啉（ 8Hydroxyquinoline） 一種有機(jī)化合物，分子式為 HOC6H3N： CHCH： CH，分子量為 。本品為白色或微紫紅色的結(jié)晶或粉末 ，溶于酒精而難溶于水。 8羥基喹啉不僅具有秋水仙素的特點(diǎn)，而且所顯示的染色體縊痕和隨體結(jié)構(gòu)，往往比秋水仙處理更為清晰。尤其在處理中小染色體材料時(shí)，這一優(yōu)點(diǎn)更為明顯。另外，其作用較前兩種藥品緩和，一般處理時(shí)間相應(yīng)要長(zhǎng)。 配制方法：配制 ，因其難溶于水，稱量的藥品撒入水中后，加溫到 60℃數(shù)小時(shí)可完全溶解 （ 李懋學(xué)，張敦芳等 ， 1991） 。 D． α 溴萘（α Bromonaphthalene） 一種苯酚衍生物，分子式為 C10H7Br，分子量為 ，常溫下為無(wú)色 或淡黃色液體，易溶于乙醇和苯，微溶于水。 對(duì)微管的作用比較緩和，對(duì)染色體縮短作用緩慢，即使延長(zhǎng)時(shí)間也不易對(duì)染色體產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。 配制方法：使用飽和水溶液。 100ml蒸餾水中滴入一滴α 溴萘，充分振搖后即可使用。該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，容易變質(zhì) （劉祖洞， 1987） 。 E． 混合藥物處理 a 對(duì)二氯苯 — α 溴萘 配制方法： 100ml對(duì)二氯苯飽和水溶液中加入一滴α 溴萘充分振搖后即可使用。 該混合液是作用力最強(qiáng)的預(yù)處理劑，作用迅速，非常適合于處理大染色體的材料，又適合于以染色體計(jì)數(shù)為目的的 預(yù)處理。當(dāng)然該試劑對(duì)細(xì)胞的毒害作用也大，造成染色體嚴(yán)重粘連，聚縮成團(tuán)，一定要掌握處理時(shí)的溫度和時(shí)間。 b 秋水仙素 — 8羥基喹啉 配制方法： %— %秋水仙素與 （ 1： 1）混合使用。兩者分別配制存放，用時(shí)混合。 應(yīng)用該混合液比單獨(dú)用 8羥基喹啉效力強(qiáng)，即可縮短處理時(shí)間，又保持了 8羥基喹啉使染色體縊痕清晰的特點(diǎn)。該溶液適用范圍較廣，對(duì)具各種大小染色體的材料都可應(yīng)用，因此最適合于作核型分析的目的 （劉祖洞， 1987） 。 F． 低溫處理 低溫也可以阻抑紡錘體微 管的組裝，與預(yù)處理試劑有異曲同工之效。但并不能適用于所有植物，不同植物對(duì)低溫的反應(yīng)不同。目前知道可以采用這一方法的植物不多，成功的例子主要是禾本科的農(nóng)作物，如小麥、黑麥、大麥用 1— 4℃，水稻、玉米用 6— 8℃可以獲得較好效果，但處理時(shí)間較長(zhǎng)。 處理方法 ： A 離體處理 將根尖從植物體上切割下來(lái)，浸入處理液中進(jìn)行前處理。 B 非離體處理 一般在植物原材料較小，如萌發(fā)的種子，而且是無(wú)土培養(yǎng)，可以采用此方法。無(wú)須切割根尖，把整個(gè)種子浸泡于處理液中即可。此方法的優(yōu)點(diǎn)是根尖生長(zhǎng)未受到斷 絕營(yíng)養(yǎng)的影響，可以獲得更多中期分裂相的細(xì)胞。但很多材料無(wú)法應(yīng)用該方法，又所需處理液較多 （ 李懋學(xué)，張敦芳等 ， 1991） 。 處理時(shí)間 ： 處理時(shí)間受下面幾個(gè)因素的影響，為其共同作用的結(jié)果。一般情況下，處理時(shí)間控制在半個(gè)工作日。 A 材料 B 染色體大小 C 處理方法 9 D 處理液濃度 E 材料大小 F 處理液溫度：多在室溫。 具體材料的處理?xiàng)l件和時(shí)間由預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索。當(dāng)然，許多植物植物都有人研究過(guò)，我們?cè)谟?jì)劃實(shí)驗(yàn)之前，首先要參考別人的工作。 如果沒(méi)有，可參照近緣物種的處理?xiàng)l件和時(shí)間。 我們實(shí)驗(yàn)室一般用 8羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理， 此液在使用的過(guò)程中需避光處理，而且若試劑因配置時(shí)間長(zhǎng)了可能會(huì)變質(zhì)，影響預(yù)處理效果。 預(yù)處理時(shí)間一般為 30min至 4h，不同種的預(yù)處理時(shí)間需對(duì)相近種的時(shí)間進(jìn)行參考，需對(duì)預(yù)處理時(shí)間多做幾次梯度試驗(yàn)，以找到最適時(shí)間預(yù)處理時(shí)間直接影響染色體的形態(tài)，因此需找到最佳時(shí)間 。 固定 固定的目的是利用化學(xué)試劑將生活細(xì)胞迅速殺死，并使構(gòu)成染色體的核蛋白變性和沉淀，以保持染色體的固有形態(tài)結(jié)構(gòu)。 固定液 ： Carnoy’s （卡諾）Ⅰ：冰乙酸：無(wú)水乙醇 = 1： 3 Carnoy’s （卡諾）Ⅱ：冰乙酸：氯仿：無(wú)水乙醇 = 1： 3： 6 通常都用配方Ⅰ，且無(wú)水乙醇也可用 95%乙醇或甲醇代替。此外其比例也可改變，如材料較硬，可提高冰乙酸的比例，如一比二，甚至一比一。配方Ⅱ主要用于某些含油脂類物質(zhì)或某些需要更加硬化的組織的固定 （ 李懋學(xué)，張敦芳等 ， 1991） 。 固定時(shí)間一般 2— 24小時(shí)，通常在低溫狀態(tài)下較好，一般在 4℃冰箱中進(jìn)行，具體時(shí)間需對(duì)相近種時(shí)間進(jìn)行參考。 解離 植物細(xì)胞外被纖維素和果膠組成的細(xì)胞壁，不經(jīng)處理其染色體無(wú)法分散開來(lái)。因此得到染色體分散良好的制片，必須先軟化和消解細(xì)胞壁 （ 李懋學(xué)，張敦芳， 1991） 。 A． 鹽酸 鹽酸是消解細(xì)胞壁最常用的試劑。多用的濃度為 1mol/L，溫度為 60℃（并不嚴(yán)格），處理時(shí)間為 5— 10 分鐘。某些禾本科的根尖材料可延長(zhǎng) 20— 25 分鐘。很多材料也可以用，同樣在 60℃解離 5— 10分鐘。 B． 酶解離 蒸餾水分別配制 2%的纖維素酶和果膠酶，用時(shí)按一定比例混合（如 1： 1）。注意材料在酶解之前一定 洗凈固定液。酶解一般在 37℃溫度下進(jìn)行，解離時(shí)間要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。 我們通常用 1mol/L的 鹽酸在 60176。 C水浴鍋中解離，具體時(shí)間亦需作梯度試驗(yàn)，可 對(duì)相近種時(shí)間進(jìn)行參考。 染色劑及染色方法 對(duì)染色體進(jìn)行染色，以方便直接的在鏡檢時(shí)鑒別出染色體并對(duì)其數(shù)目和核型進(jìn)行觀察和研究，因此染色的好壞是關(guān)鍵。 常用的染液有以下幾種： 洋紅（ Carmine） ： 從胭脂蟲提取加工而成的非結(jié)晶性染料。 配制方法 ： 鐵 — 乙酸洋紅： 100ml45%冰乙酸置 200ml三角燒瓶加熱煮沸，移去火源，緩緩（切記緩緩，否則沸騰 噴濺）加入 1g洋紅粉末，攪動(dòng)溶解。待完全溶解，重置火上加熱并以細(xì)棉線懸鐵丁于溶液中保持 12 分鐘，或者加入氫氧化鐵的 50%乙酸飽和液 12 滴（不可多加，否則沉淀）。配制完成后，室溫下靜止約 12 小時(shí)，過(guò)濾于棕色滴瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆?。鐵為媒染物，染色液中含有微量鐵可明顯增強(qiáng)染色體能力。 10 地衣紅 ： 一種地衣中提取的紫紅色染料。 配制方法 100ml45%冰乙酸置 200ml 三角燒瓶加熱煮沸，移去火源，緩緩（切記緩緩，否則沸騰噴濺）加入 2g地衣紅粉末，攪動(dòng)溶解。此為母液，裝棕色瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆?。母液?45%冰乙酸稀釋成 1%地衣紅染色液直接用于染色。 另有一種可以省略材料解離的方法是將上述母液取 9份與 1份 1mol/L HCl混合為 A液，再將母液用 45%乙酸稀釋成 1%地衣紅（ B液）。 制片時(shí)，固定的材料稍加水洗，直接投入 A液，酒精燈加熱數(shù)秒，室溫放置 30分鐘，取出材料 B液染色壓片。 乙酸地衣紅染色不能在壓片前加熱烘烤，只能在壓片之后進(jìn)行，否則退色。地衣紅易溶于酒精，制片不可用酒精脫水封片 （ 尤瑞麟， 2020） 。 堿性品紅 ： 堿性品紅為三苯甲烷類混合物。 1）卡寶品紅 （改良苯酚品紅） 配制方法 原液 A：稱 3g堿 性品紅溶于 100ml70%酒精（此液可無(wú)限期儲(chǔ)存，不會(huì)變質(zhì)）。 原液 B：取 10ml原液 A與 90ml5%苯酚水溶液混合，置 37℃溫箱溶解 2— 4小時(shí)（此液不穩(wěn)定，限 2周之內(nèi)使用）。 原液 C：取原液 B55ml與冰乙酸、甲醛各 6ml混合均勻。 染色液：取原液 C10— 20ml，加入 90— 80ml45%乙酸和 1g山梨醇混合溶解。 該染色液配制后為淡品紅色，如果立即使用染色較淡，放置 2 周后染色能力明顯增強(qiáng)，而且放置的時(shí)間越久染色效果越好。此液可在常溫下存放 2年保持穩(wěn)定不變質(zhì)。染色時(shí)采用滴染方法。注意應(yīng)用該染色液，染色的效 果與鹽酸解離有密切關(guān)系 （ 李懋學(xué)，張敦芳， 1991） 。 2）孚爾根染色法 Schiff’s 試劑：溶解 100ml煮沸的無(wú)離子水中，攪動(dòng)，使其充分溶解，