【正文】 .......................... 28 粘度密度乘積變化與△ F 的關(guān)系 .................................................................. 28 xx 大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 IV 本章小結(jié) ......................................................................................................... 30 結(jié)論 ............................................................................................................................ 31 致謝 ............................................................................................................................ 32 參考文獻(xiàn) .................................................................................................................... 33 附錄 A ........................................................................................................................ 33 附錄 B ........................................................................................................................ 40 xx 大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 1 第 1章 緒 論 課題背景 現(xiàn)代生物分析技術(shù)研究和發(fā)展的一個重要目標(biāo)就是努力簡化分析方法，使之能夠在普通和常規(guī)條件下進(jìn)行，并盡量減少操作技巧。在應(yīng)用科學(xué)領(lǐng)域，分析系統(tǒng)操作步驟和技巧的任何簡化，都被視為應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步 [1]。為實現(xiàn)此目標(biāo)進(jìn)行的種種成功嘗試使生物傳感器應(yīng)運(yùn)而生，并呈迅猛發(fā)展之勢。發(fā)達(dá)國家已形成了傳感器研究開發(fā)產(chǎn)業(yè)，無論在基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究，還是在新產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化方面都取得了驚人的成果 [2]。近年來我國也逐漸加入了傳感器技術(shù)的研究與開發(fā)力度，許多企業(yè)和民間資本更是瞄準(zhǔn)了生物傳感器廣闊 的市場開發(fā)前景和誘人的高額利潤，不惜投入巨資紛紛涉足這一高科技領(lǐng)域，組建了多個專門從事生物傳感器研究的機(jī)構(gòu)，掀起了生物傳感器研究的熱潮，極大地推動了生物傳感器的研究、開發(fā)與應(yīng)用。壓電生物傳感器在生命科學(xué)中的應(yīng)用研究與探索也成為近年來熱點(diǎn)研究方向。壓電石英晶體生物傳感器正以其靈敏的壓電質(zhì)量傳感功能及其簡單的儀器裝置、快捷的分析速度、低廉的檢測成本等優(yōu)點(diǎn)而博得化學(xué)生物學(xué)研究人員的青睞。 壓電石英晶體傳感技術(shù)是 20 世紀(jì) 60 年代建立起來的一種新型傳感測量技術(shù)。在 20 世紀(jì) 80 年代壓電石英晶體在液相穩(wěn)定振蕩獲得成功后， 壓電石英諧振測量技術(shù)才開始廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。石英晶體振蕩頻率對晶體表面質(zhì)量負(fù)載和反應(yīng)體系物理性狀如密度、粘度、電導(dǎo)率等的改變高度敏感，具有亞 ng 級的質(zhì)量檢測靈敏度，能夠敏感地測量微觀反應(yīng)過程中的微小變化并轉(zhuǎn)化為可以定量檢測的頻率信號，為獲取反應(yīng)體系豐富的實時在線信息提供了一種簡單、快捷的可靠手段。因此，它在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國防、生命科學(xué)等諸多領(lǐng)域極富有應(yīng)用前景 [3]。 上述石英晶體生物傳感器具有以下的優(yōu)點(diǎn)： 1． 經(jīng)濟(jì)性與簡便性：通常是選擇性好的生物材料構(gòu)成的分子識別元件，因 此一般不需要進(jìn)行樣品的預(yù)處理 ，它利用優(yōu)異的選擇性把樣品中的被檢測組分的分離與檢測統(tǒng)籌為一體，測定時一般不需要另外添加其他試劑，克服了過去試劑費(fèi)用高和化學(xué)分析繁瑣復(fù)雜的缺點(diǎn)。 2． 專一性與特異性：只對特定物質(zhì)起反應(yīng)，而且不受顏色、濁度的影響。 因為生物傳感器主要是利用酶和底物、抗原和抗體、 DNADNA 或 DNARNA等特異性識別機(jī)理，所以具有其他化學(xué)法無法比擬的優(yōu)越性。 3． 便攜性與實時性：體積小便于攜帶，可以實現(xiàn)連續(xù)在線實時檢測和現(xiàn)場 檢測。 4． 易操作與自動化：操作系統(tǒng)比較簡單，容易實現(xiàn)自動分析，準(zhǔn)確度高， 一般相對誤差可以達(dá)到 1%。 5． 成本低與便推廣：樣品用量小，響應(yīng)快，并且由于敏感材料是固定化的 xx 大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 2 可以反復(fù)使用多次，傳感器本身成本低，價格低廉，便于推廣應(yīng)用。 壓電傳感器的發(fā)展史 1880 年，比爾和約 克 178。居里兄弟首先發(fā)現(xiàn)石英等一些晶體的壓電現(xiàn)象 [4]。他們指出，表面所形成的電荷和外加壓力成正比。壓電效應(yīng)包含有壓電效應(yīng)和逆壓電效應(yīng)兩個方面。前者是指當(dāng)壓電晶體在外力作用下發(fā)生形變時，在其某些對應(yīng)的面上會出現(xiàn)正負(fù)束縛電荷，也即沒有電場作用，只是由于形變而產(chǎn)生極化現(xiàn)象；反之，在此類晶體上施加電壓，則晶體會發(fā)生形變，這稱為逆壓電效應(yīng)。 壓電 傳感器就是利用了壓電材料所具有的壓電效應(yīng)，如以壓電石英晶體(Piezoelectric Quartz Crystal，簡稱 PQC)等一類壓電材料為基底的體聲波器件在厚度剪切模式振蕩過程中與周邊環(huán)境的相互作用，由器件超高頻聲波的聲電阻抗譜、頻譜或相位等的參量變化來對黃精介質(zhì)包括質(zhì)量、粘彈性、導(dǎo)納、介電或流變特性、離子 /溶劑傳輸?shù)任锢怼⒒瘜W(xué)性能作出相關(guān)應(yīng)答并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)傳感檢測信號，獲取有關(guān)目標(biāo)組成或多元組分體系的成分、性狀的一維或多維信息，以求得到對象的全面、動態(tài)、實時或在位描述，用于化學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)、臨床醫(yī) 學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的傳輸檢測 [5]。 目前應(yīng)用最廣泛的是市售的三明治式壓電石英晶體。專門用于檢測質(zhì)量負(fù)載的 PQC 傳感器稱為石英晶體微天平 （ Quartz Crystal Microbalance,簡稱QCM）。 QCM 的應(yīng)用始于 60 年代初，是一種非常靈敏的質(zhì)量監(jiān)測器，可以進(jìn)行納克級的質(zhì)量測定 [6]。 1959 年 [7]導(dǎo)出了 QCM 的頻率響應(yīng) F? 與沉積在其電極表面的質(zhì)量 m? 的關(guān)系： 2/1202 2 ）（ qqAmFF ?????? (1— 1) 其 中 0F 、 A、 q? 和 q? 分別為石英晶體的基頻、電極的面積、彈性模量和密度。由于 Sauerbery 方程首先是在真空或氣相條件下導(dǎo)出的， 1964 年 King 首先利用 QCM 技術(shù)成功地支撐氣體傳感器使得 QCM 在氣相分析等領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用，文獻(xiàn) [8]已做了詳細(xì)的綜述。 進(jìn)入 80 年代，壓電傳感領(lǐng)域的幾個著名研究組如： ,姚守拙， 等組相繼發(fā)表了晶體在液相中穩(wěn)定振蕩成功地研究論文 [9]，從而大大拓寬了壓電在傳感領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。自此壓電晶體其它的一些非質(zhì)量傳感特性如：電導(dǎo)傳感、密度傳感、粘度傳感等亦被相繼揭示與應(yīng)用，至 90 年代末形成了壓電體聲波質(zhì)量傳感與非質(zhì)量傳感并行發(fā)展的研究姿態(tài) [10]。 直至今日，壓電傳感器的分析技術(shù)仍以傳統(tǒng)的振蕩器方法為主，雖然振蕩器法只能提供 PQC 的串聯(lián)共振頻率這一單一的信號， PQC 在粘度過大的液相中還容易停振，而且其振蕩行為受振蕩電路類型和元件參數(shù)的影響 [11]， 但這種直接測頻法的突出優(yōu)點(diǎn)是簡單，對于一般的并不復(fù)雜的體系，采用這種方法完全能夠滿足分析的需要。 xx 大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 3 壓電生物傳感器的研究進(jìn)展 壓電生物傳感器是一種將高靈敏度的壓電傳感器與特異的生物反應(yīng)結(jié)合在一起的新型生物分析方法，這一方法不需要任何標(biāo)記，且儀器結(jié)構(gòu)簡單、操作方便，引起人們的濃厚興趣，組建成為生物傳感器領(lǐng)域中的一項研究熱點(diǎn)。近年來在生物分析方面也取得長足進(jìn)展，以下僅從免疫、基因及細(xì)胞等方面作些介紹。 1． 壓電免疫傳感器 壓電免疫傳感器的基本原理就是將抗體或者抗原固定于石英晶體表面，利用抗原與抗體的特異親和反應(yīng)， 當(dāng)待測的抗原或抗體與所固定的識別物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生特性吸附時，就會導(dǎo)致晶體表面質(zhì)量負(fù)載的增加，所吸附的抗體或抗原的量可以通過傳感器的頻率變化加以檢測。因為壓電傳感器測定的是質(zhì)量變化，無需經(jīng)典的免疫分析方法如放射性同位素標(biāo)記法及酶聯(lián)偶合法中的標(biāo)記和分離步驟，可以簡化操作程序，提高分析速度 [12]。早在 1972 年， shons 等便以抗原（牛血清蛋白，馬 r球蛋白）作為晶體涂層，用于檢測溶液中的抗體活性。由于當(dāng)時壓電傳感器只能在氣相中振蕩，因此需抗體吸附于晶體表面并干燥后才能進(jìn)行質(zhì)量測定。直接在溶液中進(jìn)行測定的最先 為 Roederer 等人的工作，他們以硅烷修飾晶體表面以獲得對蛋白質(zhì)高度親和的表面后，再將 antiIgG固定于晶體表面以測定溶液中的 IgG。和其它免疫化學(xué)傳感器一樣，抗原或抗體的固定化技術(shù)是制備免疫傳感器的關(guān)鍵。固定化過程既要把目標(biāo)蛋白質(zhì)固定于載體表面，又要保留蛋白質(zhì)的活性。在壓電晶體表面直接固定蛋白質(zhì)易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活，因此一般需要對晶體表面先進(jìn)行修飾，然后再在修飾層上固定抗體或抗原。 另外，壓電免疫傳感器已用于微生物檢驗研究。 Park 等利用 SulfoLCSPDP 自組裝技術(shù)把琉基化得沙門氏菌抗體固定在 10MHZ 的石英晶體表面，提高了檢測的靈敏度和特異性。以硫酸鹽緩沖液來檢測細(xì)菌標(biāo)本懸液中的目的細(xì)菌，該方法的檢測范圍在 510? ~ 810? CFU/ml。 Wong[13]等采用覆蓋聚乙烯亞胺薄膜的銀電極上用戊二醛交聯(lián)劑固定單克隆抗體，來區(qū)分和檢測沙門氏菌的 ABD 血清型；在 510 ~5 810? cells/ml 的范圍成線性關(guān)系。 2． 壓電基因傳感器 壓電傳感器測定 DNA 的基本原理是將單鏈 DNA 探針固定到晶體表面，當(dāng)序列與之互補(bǔ)的待測 DNA 在晶片上雜交形成雙鏈 DNA 時，晶體的質(zhì)量增加和產(chǎn)生表面粘彈性變化，根據(jù)傳感器頻率變化或網(wǎng)絡(luò)分析加以測定 [14]。 日本 Okahato 等人采用了一個 9MHz 的 AT 切割的鍍金的石英晶體，利用10 個堿基的能與單鏈的 M13 噬菌體 DNA 的 EcorⅠ結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸作為探針， 研究了由于雜交引起 的頻率差隨時間的變化，獲得了滿意的結(jié)果 [15]。同時，他們還研究了不完全互補(bǔ)的靶 DNA 的雜交情況。結(jié)果表明，當(dāng)有一個連續(xù)的互補(bǔ)堿基存在時，也可以進(jìn)行雜交，但隨著互補(bǔ)堿基的數(shù)量下降雜交也變得越來越不穩(wěn)定。他們還研究了溫度對雜交的影響，發(fā)現(xiàn)在 55~60℃ 之 xx 大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 4 間，隨溫度的上升，雜交雙鏈開始熔鏈，熔點(diǎn)為 60℃ 。 Ito 等觀察了溶液酸堿度對 DNA 連接的影響，發(fā)現(xiàn)在酸性或堿性條件下，DNA 探針連在電極上的量最多，而在中性溶液中， DNA 雜交效果最好。還發(fā)現(xiàn)將雙鏈 DNA 連在電極上之后加熱變性成單鏈，比單鏈 DNA 直接連在電極上雜交的 DNA 量多。他們認(rèn)為出現(xiàn)這種差異肯呢個是由于連在電極上的單鏈DNA 所產(chǎn)生的雜交空間位阻比雙鏈 DNA 大所致。一般來說，電極上 DNA 探針量與雜交 DNA 量追之比僅為 100： DNA 嵌入劑 Hoechst33258 引入到實驗體系中，發(fā)現(xiàn) Hoechst33258 的潛入量與雜交 DNA 量成線性關(guān)系。Hoechst33258 的引入不僅提高了檢測的靈敏度，而且為 DNA 和 DNA 嵌入劑的定量分析提供了新的研究途徑 [16]。 3． 壓電傳感器應(yīng)用于細(xì)胞核微生物研究 根據(jù)細(xì)胞在培養(yǎng)液中的狀態(tài)可以把細(xì)胞 分為懸液細(xì)胞核貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞顧名思義就是在培養(yǎng)器皿的壁上生長，細(xì)胞的分裂生長過程對應(yīng)于器壁的質(zhì)量增加過程，故可以利用壓電傳感器的質(zhì)量特性對細(xì)胞生長過程進(jìn)行監(jiān)測。Redepenning 等人用壓電傳感器對成骨細(xì)胞 osteoblasts 的貼壁速率進(jìn)行了監(jiān)測，并用掃描電子顯微鏡測定細(xì)胞的表面覆蓋率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)晶體的頻率下降值與晶體表面細(xì)胞的覆蓋率有線性關(guān)系，但信號主要來自細(xì)胞貼壁所導(dǎo)致的表面粘度變化，因此 Sauerbrey 方程不成立 [17]。這已結(jié)果也在預(yù)料之中，因此細(xì)胞的典型直徑約為 10um，比壓電晶體表面聲波 的作用距離大得多，細(xì)胞中只有貼壁的一小部分參與晶體的振蕩；另外，細(xì)胞在表面不是均勻剛性膜，而且細(xì)胞含大量的細(xì)胞漿，在溶液中細(xì)胞還受溶液的浮力作用。由于在細(xì)胞與晶體的作用中，粘彈性的作用大于質(zhì)量作用，所以在壓電傳感器的檢測方式上，除采用頻率外還以阻抗分析法測量與能量損耗有關(guān)的參數(shù)。此外，細(xì)菌生長過程中的新陳代謝作用也會改變培養(yǎng)基的物理活性參數(shù)如粘度等，這一現(xiàn)象也可用壓電傳感器加以監(jiān)測。 論文研究內(nèi)容 本文主要闡述壓電石英晶體生物傳感器對凝血因子檢測系統(tǒng)的研究過程。介紹了血漿凝血因子檢測系統(tǒng)的工作原理。壓電石英 晶體生物傳感器以石英晶體的壓電諧振電路為核心，利用石英晶體的“逆壓電效應(yīng)”，