【正文】 )。 MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基 ,兼?zhèn)湟蕾囉?RNA和依賴于 DNA的 DNA合成活性 ,但降解 RNADNA雜交體中的 RNA的能力較弱 ,且對熱的穩(wěn)定性較 AMV反轉錄酶差。 2)普通逆轉錄酶反應溫度為 3742度，然而一些有豐富二級結構的復雜模板或者高 GC含量的模板在常溫下擴增困難，需要將逆轉錄反應置于較高溫度下進行改善擴增。對于較高的反應溫度，建議使用 cMASTERRT酶，該酶在 3760度的溫度范圍內都能保持良好的活性，使用 cMASTERRT酶，可以增加反應產量，還可以增加逆轉錄反應的特異性。因為，對于使用基因特異性引物（ GSP）進行cDNA合成時，較高的反應溫度允許使用 Tm值較高的基因特異性引物。 ?Taq酶 普通的 Taq酶擴增能力很強但是錯配率高，雖然高產但是最大只能 擴增 35kb的片段；而本身帶有校讀功能的高保真酶有很高的保真度，不易出錯，可擴增較長的片段，但是產量偏低。TripleMaster酶則是一個高保真的混合酶 — 在保留 Taq酶的高聚合能力，保證高產的同時，還有效降低了 Taq的錯配率，大大提高了保真性。 ?RTPCR buffer ?引物： (1)上下游引物設計在跨內含子的兩個外顯子的 3’端和下一個外顯子的 5’端，這樣不會在基因組上擴出來。 (2)設計在兩個離得遠的外顯子上，這樣從基因組和 cDNA上得到的片段長度不一樣，可以一引兩用 。 Random 9mers 適用于長的及具有 Hairpin構造的 RNA。適用于rRNA、 mRNA、 tRNA等所有 RNA的反轉錄反應 (用 Random 9mers合成 cDNA后，任何特異性的Primer pair都可用于 PCR反應 )。 Oligo dTAdaptor Primer 適用于具有 Poly(A)+ tail的 RNA。 注 : 原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA及 tRNA (某些種類真核生物的 mRNA)不具有 Poly(A) tail。本Primer設計巧妙，反轉錄效率高。反轉錄反應后，用 M13 Primer M4可進行 339。RACE。 ?一步法： 利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉錄酶、引物、Taq酶、 4種 dNTP 直接進行 mRNA反轉錄與 PCR擴增。發(fā)現(xiàn) Taq酶不僅具有 DNA多聚酶的作用，而且具有反轉錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以 mRNA為模板進行反轉錄和其后 PCR擴增，從而使 mRNA的 PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總 RNA中小于 1ng的低豐度 mRNA。該法可用于低豐度 mRNA的 cDNA文庫的構建及特異 cDNA的克隆，并有可能與 Taq酶的測序技術相組合，使得自動反轉錄、基因擴增與基因轉錄產物的測序在單管中進行。 ?RTPCR— 一步法和兩步法 兩步法：由于單管反應時 RT和 PCR都不能在最佳條件下進行并且 容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴增較短的基因，及定量 PCR。兩步法則是將 RT和 PCR分別進行，這樣使得兩個反應充分發(fā)揮各自的特點，更為靈活而且嚴謹，適合那些 GC含量、二級結構嚴重的模板或者是未知模板，以及多個基因的 RTPCR。 ?RTPCR— 一步法和兩步法 兼并引物 PCR（ Degenerate Primer） 密碼子的 簡并 性 氨基酸 密碼子數 Ｍ、Ｗ １ Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｙ ２ Ｉ ３ Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ ４ Ｌ、Ｒ、Ｓ ６ 簡并引物是 指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。 簡并度越低，產物特異性越強。設計引物時應盡量選擇簡并性小的氨基酸，并避免引物 3’ 末端簡并， 因為 339。端最后 3個堿基的退火足以在錯誤位點起始 PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。 兼并引物 PCR（ Degenerate Primer） 巢氏 PCR（ Nested PCR） ? 巢氏 PCR需要兩到三對引物，一般采用 第一套引物擴增 1530個循環(huán)，再用擴增 DNA片段內設定的第二套引物擴增 1530個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結構卻很少擴增。套式引物 PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。 ? 若將套 式 PCR的內外引物稍加改變，延長外引物長度（ 2530bp），同時縮短內引物長度（ 1517bp），使外引物先在高退火溫度下復性，做雙溫擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使內引物在外引物擴增的基礎上，在低退火溫度復性，直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。 反向 PCR（ Inverse PCR） 反向 PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的 DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向 PCR可用于研究與已知 DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又稱為染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心 DNA兩末端序列互補，但引物 3’端是相互反向的。 反向 PCR的操作流程：擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然后用 DNA連接酶連接成一個環(huán)狀分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段。 ?選擇多種限制性內切酶，基本準則是選擇不能在非酶切位點切斷靶 DNA的酶。裂解核心區(qū)的內切酶使反向 PCR只能擴增引物所定模板 (依賴于引物 )的上游或下游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩側序列都擴增 ?Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環(huán)化及反向 PCR的片段的末端片段 ?大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，所以往往需要兩組到三組嵌套引物 反向 PCR（ Inverse PCR） ?不對稱 PCR（ Asymmetric PCR） 不對稱 PCR的基本原理是采用不等量的引物產生大量的單鏈 DNA（ ssDNA）。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為 1： 50~1： 100，關鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于 ssDNA。 不對稱 PCR反應過程：一般來說，在不對稱 PCR反應中，在 開始的 2025個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈 DNA，當限量的那個引 物耗光后，隨后的 510個循環(huán)就產生出 ssDNA。 產生的 dsDNA與 ssDNA由于分子量不同，可以通過電泳分離。 一般對 100μl PCR反應體系而言，當引物比率為 50pmo:，經過 30個循環(huán) 后，大約可產生 13pmol的 ssDNA。 ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計 : a)在 ssDNA合成過程中，摻入 32PdNTP。取10%的反應產物，經過瓊脂 糖電泳分離后，放射自顯影。 b)取 5%的反應物來走 膠，轉移到膜上，并用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。 不對稱 PCR— ssDNA產物量 ? 解決不對稱 PCR反應擴增效率低的方法： ?