實(shí)驗(yàn)一-光學(xué)顯微鏡的使用與微生物觀察(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-05-05 23:19:36 本頁(yè)面
【正文】 負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。例如，美藍(lán)(亞甲藍(lán))實(shí)際上是氯化亞甲藍(lán)鹽(methylene blue chloride，縮寫(xiě)為M B C)；它可被電離成正、負(fù)離子：M B C174。methylene blue++ chloride帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。常用的堿性染料除美藍(lán)外，還有結(jié)晶紫(crystal violet)、堿性復(fù)紅(basic fuchsin)、番紅(又稱沙黃，safranine)等。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。染色前必須先固定細(xì)菌，其目的有二：一是殺死細(xì)菌，使細(xì)胞質(zhì)凝固，菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)應(yīng)盡量維持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。二、實(shí)驗(yàn)器材 菌種 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)或蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)； 儀器 顯微鏡； 材料 接種環(huán)，酒精燈，火柴，載玻片，洗瓶，廢液缸，擦鏡紙，吸水紙； 染料 草酸銨結(jié)晶紫或石碳酸復(fù)紅。三、操作步驟涂片 在潔凈無(wú)油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水，用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜。干燥 將涂片于空氣中自然晾干，或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓?，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形。 固定 手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過(guò)迅速通過(guò)火焰23次(用手指觸涂片反面，以不燙手為宜)。待玻片冷卻后，再加染料； 染色 玻片置于玻片擱架上，加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅液)于菌膜部位，染l2min。 水洗 傾去染色液，用洗瓶中的自來(lái)水自玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無(wú)染色液的顏色時(shí)為止。 干燥 自然干燥或用吸水紙 蓋在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌體)。 鏡檢 用油鏡觀察并繪出細(xì)菌形態(tài)圖。 清理 實(shí)驗(yàn)完畢，擦凈顯微鏡。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。四、注意事項(xiàng) 玻片要潔凈無(wú)油，否則菌液涂不開(kāi)。 挑菌量宜少，涂片宜薄，過(guò)厚則不易觀察。Ⅱ、革蘭氏染色法一、實(shí)驗(yàn)原理 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C．Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法。 革蘭氏染色法的主要步驟是先用結(jié)晶紫進(jìn)行初染；再加媒染劑碘液，以增加染料與細(xì)胞間的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成分子量較大的復(fù)合物；然后用脫色劑(乙醇或丙酮)脫色；最后用蕃紅復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色(紫色)者為革蘭氏陽(yáng)性菌，如被脫色后又染上復(fù)染劑的顏色(紅色)者為革蘭氏陰性菌。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。二、實(shí)驗(yàn)器材菌種 牛肉膏瓊脂斜面28℃培養(yǎng)24h的大腸桿菌(Escherichia coli)斜面菌種，牛肉膏瓊脂斜面28℃培養(yǎng)16h的枯草桿菌(Bacillus subtilis)斜面菌種；儀器 顯微鏡； 材料 載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。染料 草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，%番紅染色液；三、操作步驟 涂片 在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，分別涂布枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(注意涂片切不可過(guò)于濃厚)。 固定 將制成的涂片干燥固定，固定時(shí)通過(guò)火焰12次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。 染色⑴初染 將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度)，染色12min。傾去染色液，用自來(lái)水小心地沖洗。 ⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染12min，水洗。 ⑶脫色 滴加95%乙醇，脫色2025s立即水洗，以終止脫色。 ⑷復(fù)染 滴加蕃紅，染色23min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)；被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G)。四、注意事項(xiàng)革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間。如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌作練習(xí)，以掌握脫色時(shí)間。當(dāng)要確證一個(gè)未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)做一張已知革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的混合涂片，以資對(duì)照。染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。選用培養(yǎng)1624h菌齡的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。問(wèn)題與思考（1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？（2）當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)六、藻類的培養(yǎng)、觀察、計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解藻類生長(zhǎng)的基本條件和方法，掌握淡水微藻的基本培養(yǎng)方法；顯微鏡下觀察并識(shí)別幾種常見(jiàn)淡水微藻；了解血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理，掌握血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)方法。二、實(shí)驗(yàn)材料：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻；三、主要實(shí)驗(yàn)儀器和器皿１．顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)器 ２．培養(yǎng)瓶（三角瓶） ，量筒； 四、試劑１．培養(yǎng)液： BG11 培養(yǎng)液 ２．碘固定液五、培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度：1200Lux、溫度：2025℃、光照時(shí)間：24h連續(xù)光照六、方法和步驟前期準(zhǔn)備：各種器皿的消毒、培養(yǎng)液的配制、準(zhǔn)備并培養(yǎng) 3 種不 同的淡水微藻：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻；接種：將不同的實(shí)驗(yàn)藻種分別接種到盛有培養(yǎng)液的不同三角瓶 (100ml)中,接種的藻容量和新培養(yǎng)液之間的比例為 1：2～1：3。培養(yǎng)量與總?cè)萘康谋刃∮?2/3；培養(yǎng) ：按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過(guò)程中，每天搖瓶 3 次，使藻類充分見(jiàn)接觸氧氣和光照； 換代：57 天換代 1 次，換代濃度同上； 固定：將藻液搖勻，用小三角瓶分別倒取一定量(2030ml)的上述3種藻液加入幾滴碘液，搖勻殺
化學(xué)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1