【正文】 R buffer 181。LMgCl2（25 mM） 181。L下游引物（10 μmol/L） 181。L滅菌雙蒸水 181。56 ℃ 45 min。 結(jié)果分析與判定 ％瓊脂糖凝膠板的制備 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。每次電泳至少加1孔陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照，沒有陽性對(duì)照的情況下，一定加Marker。 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。5 診斷判定如果是在免疫后20 d采集的樣品，PCR檢測(cè)結(jié)果陽性，表明該豬（群）已感染野毒，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定豬群是否發(fā)病。2 范圍 適用于豬細(xì)小病毒（PPV）病的PCR診斷。 主要試劑 TEN緩沖液 10％SDS 20 mg/mL 蛋白酶K 飽和酚 酚：氯仿：異戍醇（25:24:1） 氯仿：異戍醇（24：1） 純乙醇 mmol/L dNTP 10PCR Buffer 25 mmol/L MgCl2 10 μmol/L引物 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 瓊脂糖 CYBgreen4 操作步驟： 樣品的采集：采集病豬的淋巴結(jié)、脾臟、肝臟置20 ℃保存。b) μl,加入25 μl 10％ μl的20 mg/mL 蛋白酶K，50 ℃水浴搖床上放置2 h。d) 離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次。f) 用乙醇沉淀，真空抽干后加入20 μl雙蒸水溶解，20℃貯存?zhèn)溆谩?結(jié)果分析與判定 ％瓊脂糖凝膠板的制備 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。每次電泳至少加1孔陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照，沒有陽性對(duì)照的情況下，一定加Marker。 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。十一、口蹄疫(FMDV)PCR診斷技術(shù)1 引用標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T189352003和OIE FMDV參考實(shí)驗(yàn)室的方法（NB: VERSION ADOPTED MAY 2006）。3 樣品采集 水泡液和水泡皮：用一次性注射器抽取水泡液，用灼燒的止血鉗封死注射器前端，放入保鮮盒，加冰貯存送檢；將水泡皮剪下，放入干凈青霉素瓶中，放入保鮮盒加凍貯存送檢。取樣后放入干凈青霉素瓶或干凈食袋中，于保鮮盒內(nèi)加冰貯存送檢。4 樣品處理 水泡皮、臟器等：取12 g用無菌PBS緩沖液（ M, ）沖洗干凈，剪碎、研磨，用PBS稀釋成1:2~1:5的懸液置4 ℃冰箱過夜。 鼻咽拭子：加入2 mL PBS緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉簽8000 rpm離心5 min，取上清液。5 PCR診斷 引物根據(jù)Genbank中AsiaI Jiangsu株自行設(shè)計(jì)引物，片段大小約330 bp，序列如下：Asia1: 5′ACTCACCCAGCCCAAGAGCAC3’Asia2: 5′GCGTGCAAGGGCGGCGAGATC3’根據(jù)武漢大學(xué)在Genbank中公開發(fā)表的序列自行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段大小約350 bp，序列如下：O1: 5′GTCAAGCCACAGGAACAGG3′O1: 5′AGAGTTCTTTCTGCCTTCTGAGC3′ RNA提取a) 取處理好的稀釋樣品200～300 181。L TRIZOL試劑，渦懸15 s混勻，室溫靜止3 min；加入200 181。L到一新的離心管中， mL的異丙醇，混勻，室溫靜止10 min，2~8 ℃ 20000 g離心10 min；c) 棄去上清液，加入70% mL，振搖，2~8 ℃ 20000 g離心10 min；d) 棄去上清，干燥沉淀物（室溫約5 min）；加入20 181。 RTRNA 7 181。L于70℃水浴中5 min，然后室溫冷卻10分鐘；再加入： dNTP (10 mM) 1 181。LBSA( mg/mL) 5 181。L 混均后，37℃水浴4560分鐘。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)cDNA 181。L dNTP ( mM) 181。L上游引物（10 μmol/L） 181。LTaq DNA聚合酶（5 U） 181。L配好反應(yīng)液后，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃ 5 min94 ℃ 45 min。 共35個(gè)循環(huán)72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min。 結(jié)果分析與判定 ％瓊脂糖凝膠板的制備 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。每次電泳至少加1孔陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照，沒有陽性對(duì)照的情況下，一定加Marker。 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。十二、豬孢子球蟲診斷技術(shù)1 引用標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T 186472002。3 病原檢查 材料準(zhǔn)備 飽和鹽水。 被檢動(dòng)物新鮮糞便不少于200 g。 輕輕搖勻，經(jīng)60目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾。 傾去上清液，各管沉淀物中加入少量飽和鹽水，混勻。 用飽和鹽水加滿，蓋上蓋玻片，靜置10 min。球蟲卵囊呈橢圓形、圓形、卵圓形或梨形等不同的形態(tài)，均有卵囊壁。注意與豬艾美耳屬球蟲卵囊區(qū)別，后者卵囊內(nèi)有4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊內(nèi)含2個(gè)孢子。b) 未發(fā)現(xiàn)蟲卵的，需重復(fù)檢查5次，仍未見蟲卵，本糞樣可判為陰性。4 病理檢查 材料準(zhǔn)備 PBS。 疑為發(fā)生球蟲病的動(dòng)物的糞便。 病便檢查 對(duì)疑為球蟲感染致死或?qū)⒁赖膭?dòng)物，進(jìn)行剖檢，觀察病變情況。若腸道明顯腫大、脹起或變；腸漿膜面出現(xiàn)針尖大小，顏色為鮮紅色、褐色或白色的斑點(diǎn)或斑塊；腸內(nèi)容物充滿出血塊、脫落的上皮細(xì)胞、纖維蛋白、粘液等，呈暗紅色、橙黃色或乳白色，多為稀薄狀；腸粘膜增厚，有壞死的病灶和灰白色的斑點(diǎn)或斑塊等，可疑為球蟲病，進(jìn)一步做球蟲裂殖子或卵囊的檢查。 刮取少許粘膜，放在載玻片上，滴1~2滴PBS，加蓋玻片，置于顯微鏡下檢查。 卵囊檢查 將病變明顯的腸道，縱向切開。 或取有灰白色斑點(diǎn)或斑塊的腸道，縱向切開，用PBS洗去粘膜表面的雜物。十三、常見豬病抗體檢測(cè)方法檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)方法試劑供應(yīng)商用途豬瘟豬瘟抗原（ELISA）IDEXX公司檢測(cè)豬瘟抗原豬瘟抗體（ELISA）IDEXX公司監(jiān)測(cè)抗體水平豬瘟抗體免疫金標(biāo)檢測(cè)試紙廈門市格林沃生物技術(shù)有限公司監(jiān)測(cè)抗體水平偽狂犬野毒感染抗體（gEELISA）IDEXX公司檢測(cè)野毒感染繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)（ELISA）IDEXX公司檢測(cè)抗體口蹄疫FMDVNS抗體檢測(cè)（ELISA）IDEXX公司檢測(cè)野毒感染O型FMDV抗體免疫金標(biāo)檢測(cè)試紙廈門市格林沃生物技術(shù)有限公司監(jiān)測(cè)抗體水平O型FMDV正向間接血凝抗體檢測(cè)試劑盒蘭州獸醫(yī)研究所監(jiān)測(cè)抗體水平AsiaI型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒蘭州獸醫(yī)研究所監(jiān)測(cè)抗體水平細(xì)小病毒乳膠凝集華中農(nóng)業(yè)大學(xué)抗體流行性乙型腦炎乳膠凝集華中農(nóng)業(yè)大學(xué)抗體大腸桿菌分離鑒定北京陸橋病原沙門氏菌分離鑒定北京陸橋病原魏氏梭菌分離鑒定北京陸橋病原豬痢疾密螺旋體分離鑒定北京陸橋病原豬胸膜肺炎放線桿菌抗體檢測(cè)（IHA）蘭州獸醫(yī)研究所抗體馬獸疫鏈球菌分離鑒定北京陸橋病原弓形體抗體檢測(cè)（IHA）蘭州獸醫(yī)研究所抗體豬等孢子球蟲檢查蟲卵北京陸橋病原內(nèi)容總結(jié)
（1）豬病診斷技術(shù)規(guī)范
一、致病性大腸桿菌的檢測(cè)
1 引用標(biāo)準(zhǔn)
參考NY/T 5552002（動(dòng)物產(chǎn)品大腸桿菌、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測(cè)方法）
（2） 結(jié)果判定
觀察
每隔2～4 d開罐檢查一次，共2～4次，觀察有無溶血區(qū)及溶血菌落
（3）本菌為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑μl固體培養(yǎng)物以雙球菌為多，少量呈3個(gè)～5個(gè)排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以鏈狀為主，無芽孢，能形成莢膜
37