臨床基因擴增檢驗實驗室臨床實驗報告管理制度五篇-閱讀頁
2024-11-04 17:06本頁面
【正文】 提取的有效性。當標本為痰時，則必須先進行液化處理，再提取核酸。此外，當靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。核酸的擴增有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。(七)污染在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。測定分析前的污染源測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。在前面三個工作區(qū)中，不當?shù)膶嶒灢僮鲿鹚褂玫脑噭?、消耗品或?qū)嶒炘O備的污染。污染的避免要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述對工作區(qū)的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴增產(chǎn)物，從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面；(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性，還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性結(jié)果的先決條件。(九)質(zhì)量控制質(zhì)量控制包括兩個方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(以下簡稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評價。由于核酸擴增測定的高敏感性，所以標本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為3040kb。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M行質(zhì)控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相同。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實驗室內(nèi)的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。由于這些原因，單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結(jié)論。此外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。對逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標質(zhì)控方法也可采用外標質(zhì)控方法。此外，也可在標本制備時將外來內(nèi)標加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴增。對于DNA測定內(nèi)標可使用對有機體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。內(nèi)標可以監(jiān)控每一擴增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴增檢測的效果。這些質(zhì)控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質(zhì)量。(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。結(jié)果的報告必須簡單清楚。定量測定則必須報告量的多少，如結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報?lt。室間質(zhì)量評價所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質(zhì)量評價，評價結(jié)果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據(jù)之一。第五篇：臨床基因擴增檢驗實驗室審核流程重慶市臨床檢驗中心 臨床基因擴增實驗室驗收流程由申請實驗室提交申請文件，中心負責對文件進行審核。三個月后再組織專家進行現(xiàn)場正式驗收。若現(xiàn)場初審不通過，專家將提出限期整改意見（一般兩周內(nèi)），對實驗室進行整改，兩周后將整改報告提交至中心，由中心對整改報告進行審核，整改通過，則頒發(fā)初審合格證，允許其三個月的試運行。正式驗收合格，頒發(fā)臨床基因擴增實驗室驗證；正式驗收存在需整改的項目，將限期整改，整改合格后，頒發(fā)臨床基因擴增實驗室驗證。臨床基因擴增實驗室申請表見群共享，分初審申請表和復審申請表；申請復審的實驗室，只需復審申請文件的審核和正式驗收兩個階
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