【正文】 develop the test system so that it can support the whole testing life innovation of the author: This article introduces the software Agent technology to automate testing of embedded intelligent devices, the use of Agent39。在對MET單克隆抗體抗性和抗體對化學(xué)抑制劑旁路抗性（反之亦然）一無所知時，酪氨酸激酶抑制劑對MET的抗性機制就已經(jīng)被提出。我們培養(yǎng)生成抵抗抗體的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)這種抗性是由于MET基因大量復(fù)制擴增和它的受體顯著表達而來。值得注意的是MVDN30抗體的抗性細(xì)胞是MET耐受細(xì)胞對MET酪氨酸激酶抑制劑也很敏感。在實驗中，對MET酪氨酸激酶抑制劑存在抗性的細(xì)胞仍然對MVDN30抗體的作用敏感?？s略語：MVDN30單價DN30，TKEs—酪氨酸激酶抑制劑，HGF—肝細(xì)胞生長因子，MAPK—有絲分裂原活化蛋白激酶 可以抑制一個特定的目標(biāo)分子化合物的靶向治療法開辟了治療癌癥的新道路。靶向治療依賴于“癌基因沉癮”的概念。臨床試驗中的特定抑制劑的發(fā)展給腫瘤細(xì)胞的“Achille’s heel”的識別提供支持（溫斯坦和喬，2006）。因此，最關(guān)鍵的就是要發(fā)現(xiàn)對治療抵抗的機制并且找到繞過它們的方法。這個觀察發(fā)現(xiàn)許多腫瘤沉溺其中使得蛋白激酶成為了治療癌癥的理想目標(biāo)（巴塞爾加，2006。在臨床診斷中主要使用一種較小的激酶抑制劑和單克隆抗體來抑制酪氨酸激酶。它們能有效地瞄準(zhǔn)膜結(jié)合位點和細(xì)胞內(nèi)的激酶并且很容易在體內(nèi)擴散。這些分子的優(yōu)點在于它們具有很高的特異性。除此之外，很多針對于其他目標(biāo)的單克隆抗體正處與發(fā)展和試驗階段。在和肝細(xì)胞生長因子結(jié)合后，MET活化并啟動一個復(fù)雜的生化程序，這個過程被稱作“浸潤性上長”。很多研究結(jié)果表明MET在人類的許多腫瘤中具有活性，并且它與對直接激酶療法的持續(xù)抗性密切相關(guān)。在前期設(shè)置得到的基本結(jié)果，幾種特定的多目標(biāo)的酪氨酸激酶抑制劑和直接針對于MET或者HGF的抗體已經(jīng)進入了臨床試驗階段。對MET TKIs的抗性可能是由于一些機制，比如MET基因擴增，過度表達，MET點突變，MET平行路徑的激活和KRAS基因的擴增機制。我們以前報道過主要針對細(xì)胞外的部分MET的抑制性單克隆抗體的研究進展。因此，DN30結(jié)合到MET后的結(jié)果是使其變成可溶性的誘餌MET并且蛋白水解酶會講解MET激酶。設(shè)計了這樣一個過程就是因為DN30的結(jié)合使得MET激酶部分活化并且導(dǎo)致抗體介導(dǎo)的受體同源二聚體化和單價Fab片段失去競爭活性的一個過程。值得注意的是，MVDN30抗性細(xì)胞還會一直對MET TKIs產(chǎn)生耐受性和敏感性。我們還表明對MET TKIs 有抗性的細(xì)胞也對MVDN30敏感，所以，MVDN30和MET TKIs 對腫瘤細(xì)胞的作用是相互促進的。GTL16 是一種實驗室里的克隆胃癌細(xì)胞系。對MVDN30有抗性的EBC1細(xì)胞可以通過一個逐步的方法培養(yǎng)得到，由Sigma Tau Ramp。親代細(xì)胞用10 mg/ml 的MVDN30治療約一個月，直到生成的R10細(xì)胞開始產(chǎn)生抗性為止，R10抗性細(xì)胞又用逐步增加濃度的MVDN30治療。大約兩個月可以分離到R20抗體抗性細(xì)胞，四個月可以分離到R80抗體耐受細(xì)胞。該細(xì)胞系的遺傳身份通過一個短的串珠狀重復(fù)序列（STR）識別，這段序列在2013年7月再次重復(fù)出現(xiàn)。 Johnson)和p38MAP激酶抑制劑SB203580(Merck).用Trizol 試劑提取得到的RNA被檢測到利用多文士病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物合成，cDNA可以用實時的利用電源帶動的綠色PCR混合的PCR 技術(shù)來實現(xiàn)擴增，根據(jù)制造商的說明下面的MET和ACTIN特異性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT30。hACTIN Fw: 50GGAGGAGCTGGAAGCAGCC30。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量復(fù)制以及MVDN30抗性細(xì)胞歸一化然后被認(rèn)可。在細(xì)胞裂解前2小時把MET TKI JNJ38877605加入到指定的地方。antivinculin(V9131)from Sigma and antibactin(I19 sc1616)from Santa Cruz IgG HRPPeroxidase antibodies were from ，或MVDN30抗性的EBC1細(xì)胞(R80)都被平鋪在60mm的盤里。然后，這些細(xì)胞在不含L蛋氨酸但有500mmMCIL甲硫氨酸S35(脈沖)（易標(biāo)記）的DMEM培養(yǎng)基中處理20分鐘。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml細(xì)胞裂解液中進行測定（裂解緩沖液：1% TritonX100存在下，20 mM Tris鹽酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl補充蛋白磷酸酶抑制劑）通過使用抗Met ICD dq13單克隆抗體，而IP法利用抗Met ECD do24單克隆抗體對細(xì)胞培養(yǎng)2毫升上清液進行。免疫沉淀物中的蛋白就會被8% SDSPAGE 分開，然后轉(zhuǎn)移到3mm的紙上，80度，48小時后蛋白質(zhì)的放射性就會在投影膜上留下印記。沒經(jīng)過處理的細(xì)胞控制在藥物載體存在的條件下生長。對結(jié)合在EBC1WT,R20,R80細(xì)胞質(zhì)膜上的MET進行免疫熒光著色，這些細(xì)胞要提前在有或沒有MVDN30存在的條件下培養(yǎng)24小時。用于檢測的細(xì)胞要在PBS中用2%FBS洗滌并且在室溫下用抗MET ECD DO24 mAb(100 ng/ml)著色20分鐘。作為陰性對照，將不含初級抗MET抗體的細(xì)胞進行染色。EBC1 WT 細(xì)胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括1mg(MET254。)(MET254。254。作為對照，WT細(xì)胞用含有空載體病毒顆粒感染。在感染48小時后接種細(xì)胞用于生物化學(xué)分析。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對感染細(xì)胞的mRNA的表達水平實時定量PCR分析一樣子細(xì)胞感染72小時后進行評估。如果使用一個藥品從藥物劑量來說要比混合使用的IC50約高10倍左右，雙重增加濃度可以用于單藥使用和組合使用。使用相互排他性假設(shè)計算CI值（藥物作用機理的不同，）軟件，可上線的網(wǎng)站：，和繪制功能的FA（由這兩種藥物的組合影響系統(tǒng)分?jǐn)?shù)）。同一個實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進行兩尾t檢驗分析至少有三種生物學(xué)具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義的結(jié)果。MET TKIs或者MVDN30對EBC1細(xì)胞里的MET具有強烈的破壞它們生存和上長的能力的作用（圖A~C）。為了產(chǎn)生抗MVDN30的細(xì)胞，我們采用逐步暴露EBC1原代細(xì)胞不方法來增加抗體的濃度，并且獲得抗不同劑量抗體的細(xì)胞系（圖1b；約的分步方法詳見材料和方法部分）。在有MVDN30存在的抗性細(xì)胞的生長速度一直和WT細(xì)胞差不多（圖1C）。這種反應(yīng)減少了細(xì)胞表面的MET的大量表達，抑制了MET的活性和受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性。與抗性細(xì)胞的生化分析相反的是顯示了在相同劑量抗體存在的情況下，MET也會磷酸化并且在質(zhì)膜上的大量的MET蛋白明顯高于保存在相同條件下的WT細(xì)胞（圖1D,E）。所有的數(shù)據(jù)表明，抗EBC1細(xì)胞的MVDN30并不是通過一種足以消除它的結(jié)構(gòu)的活性的方法來下調(diào)MET，如圖1D,E所示，用MVDN30處理抗性細(xì)胞致使MET大量減少這種減少比處于同等條件下觀察的WT細(xì)胞中的減少更明顯。于是，我們評估了是否是抗性細(xì)胞中脫落的MET胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）對抗體的反應(yīng)被抑制了。當(dāng)對去處抗體24小時后的抗性細(xì)胞中MET的表達和活化進行評估時，我們觀察到MET總量強烈增加特別是結(jié)合在細(xì)胞膜上的形式（圖2B和圖1）。在脈沖代謝標(biāo)記實驗中也觀察到了相似的結(jié)果：比起WT細(xì)胞，抗性細(xì)胞合成更多的MET和MVDN30來促進MET ECD 釋放并大量增加（圖2E）。圖2F所示在抗性細(xì)胞中隨著MVDN30劑量是增加減少了大量MET在細(xì)胞膜上的表達（圖2A）和磷酸化(圖2B)。圖1抗MVDN30的EBC1細(xì)胞分子表征。對未經(jīng)過處理的細(xì)胞(100%)177。(B)在指定濃度抗體的條件下培養(yǎng)72小時的EBC1 WT細(xì)胞或產(chǎn)生MVDN30抗性的細(xì)胞(R10, R20, R40, R80)。 。與未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞(100%)177。(D)在有指定劑量MVDN30抗體存在的條件下處理24小時的EBC1WT ,EBC1R20和R80細(xì)胞的蛋白印跡。(A)在存在或不存在MVDN30的環(huán)境下培養(yǎng)24小時的EBC1 WTR20和R80細(xì)胞的上清液中MET ECD的蛋白印跡。紐蛋白作為控制基礎(chǔ)(C)在 EBC1 WT, R20 and R80 細(xì)胞中有或沒有（24小時去除）MVDN30的條件下在質(zhì)膜上結(jié)合的MET的熒光強度的箱圖。(D)在用MVDN30處理（24h）的EBC1WT R20和R80 細(xì)胞中和抗性細(xì)胞（圖2 D）中觀察到的MET總蛋白水平和MET ECD 的蛋白印跡.(E)在有或沒有MVDN30存在下的EBC1WT和R80細(xì)胞里的MET(來源細(xì)胞裂解液，上面)和MET ECD（來源與細(xì)胞上清液，底部）的用脈沖追蹤代謝蛋白標(biāo)記法的免疫沉淀分析。未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞（左圖）或者用20 mg/ml(100%)處理的R20（右圖）統(tǒng)計結(jié)果(***P , *P )。我們懷疑這可能是由于增加的啟動子活性或更高的mRNA的可用性，因為你微RNA的負(fù)控制微分表達了。然后我們評估了基因擴增的情況是因為MET大量復(fù)制是對激酶抑制劑存在抗性的機制。當(dāng)分析MET的mRNA水平時，我們觀察到MET的過度表達是WT細(xì)胞的2~3倍，達到了MET正常表達細(xì)胞(A549 and HEK293T)的60~90倍。我們觀察到，MET的mRNA以2~3倍的速度劇增，這與在存在MVDN30的條件下細(xì)胞的活性有關(guān)（圖3D）。所有實驗結(jié)果表明，嗜MET的EBC1細(xì)胞變得有抗性是因為MET的進一步擴增和過度表達從而來阻止有效的抗體介導(dǎo)的對MET活性的抑制。如圖4a,b所示，抗MVDN30的EBC1細(xì)胞在有抗體(20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80)存在的條件下生長情況顯示了當(dāng)用MET激酶抑制劑JNJ38877605(10 nM or 250 nM)處理時，細(xì)胞活性的降低和MET磷酸化作用的減弱。從抗性細(xì)胞的培養(yǎng)基中去除MVDN30會導(dǎo)致MET的表達增加（圖2B），我們研究了過度表達的生化效應(yīng)。這些細(xì)胞的蛋白印跡分析表明，隨著時間的推移逐漸增加了磷酸化（圖4D）。除此之外，在沒有MVDN30存在的條件下培養(yǎng)的抗性細(xì)胞中的p38 MAPK會受到一種小分子SB203580 的抑制使得細(xì)胞活性得以恢復(fù)（圖3）。為了證明當(dāng)去除MVDN30后過多的MET信號使細(xì)胞凋亡是正確的，我們用低劑量的MET YKI處理抗性細(xì)胞讓其充分減少但不會完全抑制MET活性（圖4）。總之，這些結(jié)果表明，MVDN30抗性細(xì)胞都是嗜MET細(xì)胞并且它們的繁殖和生存都有藥物依賴性。單獨或在有非常低劑量的MVDN30存在的條件下（~，從10倍以下的IC50開始），我們用逐步增加MET抑制劑JNJ38877605的方法來處理EBC1 WT細(xì)胞。如圖5C所示，~20 nm ~。如圖5A、B所示，多藥效應(yīng)分析表明了 EBC1 and GTL16 WT細(xì)胞的CI值都小于1，從而表明了JNJ38877605和 TKI和MVDN30聯(lián)合治療可以有效地減少嗜MET細(xì)胞的活性，劑量明顯低于單獨一種藥物治療的藥量。顯而易見，這種耐藥性機制已經(jīng)被廣泛研究。即使對關(guān)于癌癥是怎樣產(chǎn)生耐藥性抗體的了解很少，一些現(xiàn)象提示用抗EGFR 和抗HER2抗體治療的病人體內(nèi)有耐藥機制的建立。除此之外，最近的研究還證明了EGFR或HER2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以分別繞過西妥昔單抗或曲妥單抗的抑制；這些包括EGFR配體水平增加，MET RTK的擴增或過度表達，下游或平行激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它的失調(diào)可能是由于不同的機制包括過度表達，基因擴增，激活突變和受體介導(dǎo)的刺激自分泌或旁分泌的增加。MET的酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域中激活突變位點已經(jīng)在散發(fā)腫瘤中確定。在原發(fā)性腫瘤中由基因擴增引起的MET過度表達是少見的，但在肺癌和結(jié)腸癌中變得抗靶向其它RTKs治療的情況更頻繁。然而，用小劑量的激酶抑制劑延長對嗜MET細(xì)胞的處理會導(dǎo)致二倍抗性的出現(xiàn)，這種機制可以被維持比如MET擴增或突變,KRAS的擴增或EGFR家族成員的活化。這一現(xiàn)象的機理解釋依賴于染色體外的MET復(fù)制的動態(tài)調(diào)節(jié)，造成了一種癌癥對治療的適應(yīng)性程序。我們觀察到蛋白的增加平行下來是METmRNA增加的2~3倍。WT EBC1細(xì)胞和大多數(shù)嗜MET細(xì)胞一樣可以表達比正常表達細(xì)胞的約30倍多的MET；因此，在抗性細(xì)胞中2~3倍的增加可以引起MET水平比那些正常細(xì)胞中的MET水平高60~90倍。除此，作為抗性細(xì)胞識別增加的脫落的MET導(dǎo)致了MET ECD在細(xì)胞內(nèi)的累積，并且脫落的ECD可以和細(xì)胞膜上的MVDND30結(jié)合位點結(jié)合從而減少抗體的抑制效應(yīng)。有趣的是，當(dāng)MET變得非常活躍的時候，可以通過增加在MVDN30存在下的MET 的表達在這種適宜的有利的環(huán)境下來使其對藥物的去除效果減弱。信號過量可導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激（在我們的情況下，通過p38 MAPK活化）導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Das Thakur做了一個類似的觀察，這個人證明了人類黑色素瘤移植提供的抗藥性，藥物的去除使耐藥腫瘤的腫瘤消退是由于依賴BRAT信號過量。這在嗜MET細(xì)胞中也被證明是正確的，無論是抗MVDN30還是抗TKIs的EBC1細(xì)胞都表現(xiàn)出藥物依賴性并且去除藥物會致死細(xì)胞。此外，我們表明，抗體治療是活躍的細(xì)胞提供的抗酪氨酸激酶抑制劑，相反，TKI治療耐mvdn30細(xì)胞有效。這種發(fā)現(xiàn)在臨床上受到關(guān)注，因為它表明了用抗MET的抗體治療病人可能是沒用的，病人的對TKIs的抗性是由于MET表達的增加或者是它們的毒性限制了TKI的劑量。值得注意的是，盡管是幾個實驗，在用MET TKI和MVDN30治療時我們并沒能過培養(yǎng)出抗性