現(xiàn)代分子診斷技術(shù)-閱讀頁
2025-03-14 14:26本頁面
【正文】 內(nèi)有一腫物，病理切片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞 良性“ 慢性增生性囊腫 ”，未進(jìn)行手術(shù)治療。 1994年，研究者用靈敏的 PCR技術(shù)對上述漢弗萊 1967年的病理切片進(jìn)行了 P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上還沒有表現(xiàn)出惡性變化，但其 P53基因的第 227個密碼 子 已經(jīng)發(fā)生了一個核苷酸的突變。這說明，在典型癥狀出現(xiàn)之前的很長時間，細(xì)胞癌變的信息已經(jīng)在基因上表現(xiàn)出來了 P53抑癌基因 ?遺傳性疾病的分子診斷技術(shù) ? PCR－酶解鑒定 ? PCR／ OLA鑒定 ? PCRELISA檢測 ? PCRDGGE鑒定 ? 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ amplification refractory mutation system,ARMS） ? 連接酶鏈反應(yīng)（ LCR） 鐮刀形細(xì)胞貧血癥 (sicklecell anemia) ? 典型的單基因遺傳性疾病 ? 血紅蛋白的 β鏈（ β珠蛋白）的第六個氨基酸 Glu發(fā)生突變成 Val 血紅蛋白 ?鏈上 谷氨酸 變成 纈氨酸 英國女王維多利亞。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導(dǎo)致死亡。維多利亞女王在科堡主持的一次歐洲王室成員集會，與會者有 17人是她的后裔，其中有她的孫女亞歷山德拉（ 21），她同俄國沙皇尼古拉二世結(jié)婚，導(dǎo)致他們的兒子患有血友病。 2. 包含 CvnI位點(diǎn)區(qū)域的 DNA片段通過 PCR擴(kuò)增出來 。 382 256 201 181 88 條帶大小 (bp) 正常純合子 雜合子 突變純合子 CvuI處理 CvuI CvuI CvuI 256bp 201bp 181bp 88bp CvuI CvuI 256bp 382bp 88bp 正常情況 鐮刀形細(xì)胞貧血癥 PCR 擴(kuò)增 引物 1 引物 2 PCR產(chǎn)物（長 726bp） 二、 PCR/OLA鑒定 ? OLA(oligonucleotide ligation assay),寡聚核苷酸連接分析 ? 假定一個正常的基因在一個特定的位置發(fā)生了突變，比如說 150位的 T突變?yōu)?G ? 根據(jù) 150位兩邊的序列，人工合成兩段短的核苷酸鏈，使這兩段寡聚核苷酸鏈與基因的一條鏈互補(bǔ) ? 探針 X：寡聚核苷酸鏈的 3’端最后一個核苷酸正好與正常基因的 150位的的核苷酸配對 ? 探針 Y：另一段寡聚核苷酸鏈的 5’端第一個核苷酸與 151位的核苷酸配對 正?；? 探針 X3’端最后一個核苷酸就不會與目的基因 150位的核苷酸配對 由于 3’最后一個核苷酸不配對而使兩個探針無法實(shí)現(xiàn)連接 目的基因突變 兩探針與目的基因的完美配對 兩個探針就可連接起來 加入 DNA 連接酶 B 150 151 D B D 150 151 B X Y 150 151 D B D 雙鏈目的 DNA或 PCR產(chǎn)物 熱變性 單鏈目的 DNA或 PCR產(chǎn)物 加探針退火 完全配對 模板有突變 ,不完全配對 連接酶 連接酶 加入鏈霉抗生物素蛋白 加入鏈霉抗生物素蛋白 B D B 加入堿性磷酸酶 加入無色底物 加入堿性磷酸酶 加入無色底物 B D AP 變色 無色底物 有色底物 B 保持無色 無色底物 PCR/OLA分析程序示意圖 例：特異性互補(bǔ)寡核苷酸法檢測鐮狀紅細(xì)胞貧血癥 （ 1） 提取 DNA， 熱處理成為單鏈 DNA； （ 2） 以單鏈 DNA為模板 ， 僅對可能發(fā)生突變的核苷酸區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移到濾膜上 ， 熱變性成單鏈； （ 3） 分別用兩種特異性互補(bǔ)寡核苷酸分子探針 （ ASO） 雜交 。 衡量疫苗能否投入使用的標(biāo)準(zhǔn) ?—— 安全性 刪除致病基因，保留抗原性。 ? 免疫系統(tǒng)的工作機(jī)制： 體液免疫、細(xì)胞免疫 抗原 抗原肽 細(xì)胞表面復(fù)合物 活化的 B細(xì)胞（漿細(xì)胞） 淋巴因子 活化的 T細(xì)胞 抗體 殺滅抗原分子 抗原顯示細(xì)胞（如樹狀細(xì)胞 ） 吞噬，分解 MHC蛋白質(zhì) 識別、激活 殺傷 T細(xì)胞 激活釋放 激活 分泌 體液免疫 細(xì)胞免疫 二、基因工程疫苗 ?指用基因工程的方法，表達(dá)出病原物的一段基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物（多數(shù)是無毒性、無感染能力，但具有較強(qiáng)的免疫原性）用作疫苗 亞單位疫苗 ? 利用病原物的某一部分制得的疫苗 ? 明確編碼具有免疫活性的特定抗原的 DNA，一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因 ? 對于易變異的病毒 (如 A型流感病毒 )則可選擇各亞型共有的核心蛋白的主要保護(hù)性抗原基因序列 ? 應(yīng)用重組 DNA技術(shù)研制亞單位疫苗，還必須有合適的表達(dá)系統(tǒng)用來生產(chǎn)基因產(chǎn)物 ?優(yōu)點(diǎn)： ①避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危險 ②亞單位疫苗利用純化的蛋白質(zhì)作為免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混雜等造成的種種副作用 ③有時單獨(dú)使用特異蛋白能增加疫苗的效果 局限性： ①純化單一的蛋白質(zhì)十分昂貴 ②純化后的蛋白質(zhì)的構(gòu)象與在體內(nèi)可能不同，從而導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化 ③ 亞單位疫苗一般不具有感染性 不能激活 MHCI分子，也很難激活殺傷性 T細(xì)胞，激活的免疫反應(yīng)一般較弱 制備亞單位疫苗的基本前提是鑒定出病原物中哪些成分能激活機(jī)體產(chǎn)生抗體 肽疫苗 衣殼蛋白組成的外殼 病毒衣殼 病毒核酸 短肽 銜接物 ? 只有位于病毒衣殼外表可以與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)域才能引起免疫反應(yīng) ? 類似于抗原決定簇的小肽充當(dāng)疫苗 ? 雙肽：兩個肽段連接形成一個較長的肽 不用載體蛋白保護(hù)，比其他任何一個肽段單獨(dú)使用更加有效 ? 與強(qiáng)免疫原性的載體蛋白－乙肝核心蛋白基因連接 ? 限制因素： ①充當(dāng)抗原抗原決定簇的肽段不能太長，而且要連續(xù) ②要求肽段的構(gòu)象必須與完整病毒上的抗原決定簇構(gòu)象一致 ③要求選定的單一抗原決定簇必須要有足夠強(qiáng)的免疫原性 三、 DNA免疫 ? 基因免疫、核酸免疫 ? Wolf （ 1993）將流感病毒核蛋白 P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種亞型 T
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