【正文】 L）乳過氧化物酶 25ng（ 10μL）葡萄糖氧化酶 10ng （ 10μL）室溫4~20min葡萄糖 (%) 5μL (2) % 疊氮鈉 100μL 中止反應(yīng)(3) 用 Sephadex柱層析 分離純化724. 固相氧化法固相酶法 : 將乳過氧化物酶等交聯(lián)在瓊脂糖凝膠上氯甘脲法 :( Iodogen )NN NNOOClCl ClCl固相氧化劑（溫和）1,3,4,6四氯 3a,6a雙苯基甘脲73⑴ 1mg 氯甘脲 溶于 25mL二氯甲烷，取 50μL加入 3mL試 管中，用 N2氣吹干，在試管底部形成 氯甘脲薄膜 20℃ 條件下可保存半年 （ Iodogen管 ）(2)試管中加入： Na125I 37MBq （ 10μL ） 緩 沖液（ ） 30μL蛋白質(zhì) 5μg （ 10μL ）室溫3min(3)取出反應(yīng)液，上柱 分離純化 125I蛋白質(zhì)特點(diǎn) ： 標(biāo)記率高，標(biāo)記蛋白損傷少雜質(zhì)少，多為單碘化合物74二、75聯(lián)接標(biāo)記法 (Bolton－ Hunter法 )CH2CH2C－ O － NHOOOO125I 125ICH2CH2C－ O － NOHOOO+NH2－ CHC－OCH2CH2C－HOO125I 125INH－ CHC－O3－ (對羥基苯 )丙酸－ N －琥珀亞胺酯125I－標(biāo)記蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)分子末端氨基Na125ICh－ T(聯(lián)接試劑 )76室溫1~3 min具體操作方法：⑴ 碘化 ： 琥珀亞胺酯 Na125I 74MBq氯胺－ T 50μg（ 10μL）Na2S2O5 120μg（ 10μL)NaI 2mg苯 250μg(2)聯(lián)接 : 分離上述苯液，移入試管，用 N2氣吹干后加入 :蛋白質(zhì) 10μgPB(pH8) 50μL 室溫 10~30 min甘氨酸 () 500μL 0℃ , 5 min(3)上柱分離純化 125I標(biāo)記蛋白質(zhì)77優(yōu)點(diǎn) :二步操作，避免蛋白質(zhì)變性 缺點(diǎn) :1. 標(biāo)記率低2. 蛋白質(zhì)接上琥珀亞胺酯，分子較大，影響活性 1. 14C標(biāo)記化合物的制備2. 氚標(biāo)記化合物的制備3. 放射性碘標(biāo)記物的制備4. 32P、 33P和 35S標(biāo)記化合物的制備5. 核酸和反義核苷酸的標(biāo)記 主要用于標(biāo)記核苷酸79第四節(jié) 放射性標(biāo)記化合物的純化和鑒定80216。待標(biāo)記物中雜質(zhì)亦被標(biāo)記，如蛋白標(biāo)記中的雜蛋白；216。一、放射性雜質(zhì)的來源216。標(biāo)記率 (%)=標(biāo)記物的放射性 /投入的總放射性 100%測定方法： 最常用 紙層析 或 薄層層析法 ，對于生物制劑有時也用柱層析或蛋白沉淀法。 常用比移值 Rf表示各組分的移動速度快慢。Rf = 待測組分到原點(diǎn)的距離 I 流動相前沿到原點(diǎn)距離 L83標(biāo)記率測定 之 分段測量法84標(biāo)記率測定 之 放射線掃描法展開實(shí)驗(yàn)注意問題展開實(shí)驗(yàn)注意問題1. 層析紙長度，一般 20cm左右，越長分離越好；2. 展開劑要精心設(shè)計，選 23種進(jìn)行驗(yàn)證。3. 點(diǎn)樣斑大小適當(dāng)。5. 層析缸要有蓋，減少干擾。薄層層析法：a) 硅膠或氧化鋁 （固定相）：根據(jù)混合物各組分的吸附力和分配系數(shù)不同而分開。c) 聚酰胺 ：以各組分氫鍵吸附能力不同而分開。? 特點(diǎn) ：簡便、快速，但僅能適用于少量體積的樣品的純化。90（ 3） 柱層析法：?根據(jù)被純化物的性質(zhì)，采用不同內(nèi)容的層析柱和選擇合適的淋洗條件：a)凝膠過濾層析法 ：本法是利用具有分子篩效應(yīng)的多孔網(wǎng)狀凝膠來分離不同分子量的化合物。?凝膠主要有三類：① sephadex交聯(lián)葡聚糖多孔凝膠；② sepharose或 biogelA瓊脂糖珠；③ biogelP聚丙酰胺91b) 離子交換層析法 ：依據(jù)的原理是物質(zhì)的酸堿性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。c) 親和層析法 ：對于具有較強(qiáng)特異性結(jié)合作用的抗體和抗原，受體和配基等親和性的互補(bǔ)物，可將其中的一種結(jié)合在層析柱的固定相上，例如將某抗原固定在層析柱的介質(zhì)上，的那個含有相應(yīng)抗體的樣品通過層析柱時，由于抗原 抗體的結(jié)合反應(yīng)，抗體被滯留在柱上，經(jīng)洗滌將抗體中各種非特異性的雜質(zhì)洗掉，完后改變洗脫液的濃度或 pH值，將抗體洗脫出來，這種利用親和層析載體固相化配基與親和互補(bǔ)物之間，通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發(fā)生專一性結(jié)合而進(jìn)行分離的技術(shù)稱之為親和層析法。本法比較簡易，但較費(fèi)時。放射性濃度測定： 取 1ml產(chǎn)品，測其放射性活度，即為放射性濃度，單位為 Bq/ml。四、標(biāo)記物的鑒定95： 標(biāo)記物制備過程中的各種因素都可能導(dǎo)致生物活性、免疫活性的改變，因此，生物學(xué)活性、免疫活性測定是一個重要的質(zhì)量指標(biāo)。四、標(biāo)記物的鑒定96第五節(jié) 放射性標(biāo)記化合物的輻射自分解97輻射自分解 (autoradiolysis)： 由于標(biāo)記化合物所含放射性核素電離輻射的作用，致使標(biāo)記化合物本身或臨近的分子的結(jié)構(gòu)被破壞，從而喪失原有特性的現(xiàn)象。如 3H丙醇，由于輻射自分解，產(chǎn)生甲烷，乙醛，丙醛，異丙醇及丙烯醇等。一、輻射自分解的方式99初級外分解： 標(biāo)記核素所發(fā)出的射線 直接作用 于標(biāo)記化合物 本身或臨近的同種分子 ，使得該分子的電離、激發(fā)并最終導(dǎo)致其化學(xué)鍵斷裂，比放射性愈高，標(biāo)記分子愈集中，這種作用愈明顯。一、輻射自分解的方式100二、影響輻射自分解的因素標(biāo)記化合物發(fā)射射線種類及能量 不同種類的射線， 電離能力強(qiáng)，造成的輻射自分解就越嚴(yán)重。同種射線如同為 β 射線，能量不同，造成的輻射自分解結(jié)果也不同。 101二、影響輻射自分解的因素標(biāo)記化合物的比活度及濃度 標(biāo)記化合物的比活度或濃度愈高，化合物分子愈集中，它們相互間也就愈易受到自身射線的照射而使輻射自分解加重。所用的溶劑儲存溫度等 一般來說，溫度越低，輻射自分解越慢。 選擇適當(dāng)?shù)娜軇┘尤胱杂苫宄齽?常用 少量 (1%～ 3%)乙醇。定期純化 三、控制輻射自分解的方法103 THANK YOU!