基因工程復(fù)習(xí)題(答案版)-閱讀頁
2024-08-24 22:47本頁面
【正文】 構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱?，轉(zhuǎn)化效率越低；3）受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型： （1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。3）差異顯示PCR（DD RTPCR）利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。5）擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多樣性（AFLP）基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。在列陣雜交的基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)行雜交測(cè)序，從而測(cè)定每個(gè)cDNA克隆子的序列。優(yōu)點(diǎn)：l 簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。l 各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。缺點(diǎn)：l 假陽性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。l 無法定量研究。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；l 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；l 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。A．酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域（DNAbinging domain,BD），一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達(dá)。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。TDNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。 建立突變體基因組文庫(kù)及野生型基因組文庫(kù).216。216。216。第七章 克隆基因的表達(dá)通過比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架； 242。繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定； 242。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)： 242。缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)； 242。周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。 具有強(qiáng)的受嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動(dòng)子252。 營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低252。 表達(dá)蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問題（這個(gè)找不到，百度的）如何提高克隆基因的表達(dá)水平？1）、表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)；2）、提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；3）、密碼子偏愛性；4）、表達(dá)環(huán)境條件的優(yōu)化。 表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子；終止子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）；篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn)克隆載體：篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)粒拷貝數(shù)）；多克隆位點(diǎn) 根據(jù)表達(dá)蛋白用途的不同，設(shè)計(jì)選擇基因的表達(dá)策略。第八章植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線l 分離目的基因l 目的基因與恰當(dāng)?shù)妮d體DNA形成重組DNAl 重組DNA的擴(kuò)增l 目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞l 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株l 轉(zhuǎn)基因植株的大規(guī)模種植外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男?？Y 物理方法：電擊法、基因槍法(biolistic)、顯微注射法、微激光束法Y 化學(xué)方法：PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法Y 生物學(xué)方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法運(yùn)用已學(xué)的知識(shí)，如何全面分析獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體（提示：包括外源基因是否整合，被插入位點(diǎn)分析，外源基因是否表達(dá)，表達(dá)量如何？等）對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)與鑒定的對(duì)象 ——報(bào)告基因 ——目的基因(1)基因組水平的檢測(cè)與鑒定（外源基因是否整合，被插入位點(diǎn)分析）：可以用PCR擴(kuò)增結(jié)合Southern Blotting進(jìn)行驗(yàn)證。(3)基因的翻譯水平的檢測(cè)與鑒定（表達(dá)量）：可用Western Blotting或者ELISA。(1)位置效應(yīng)：指插入部位及其周圍序列對(duì)外源基因的影響(2)DNA甲基化：包括編碼序列和啟動(dòng)子的甲基化(3)重復(fù)序列誘發(fā)基因沉默：多拷貝串聯(lián)重復(fù)序列易引起外源基因的失活；(4)共抑制（cosuppression）：具有部分同源性的外源基因和植物內(nèi)源基因相互作用引起的沉默現(xiàn)象
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