【正文】 ?！　〖?xì)胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細(xì)胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到最大活細(xì)胞濃度的比率。它以被測1000個細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來計算。　　基本步驟：　　(1)細(xì)胞準(zhǔn)備 用蓋片(支持物)培養(yǎng)法?！　?3)顯微鏡下選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞并計數(shù)。觀察時要掌握好分裂相標(biāo)準(zhǔn)，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。接種12～15瓶。每2小時一次，共觀察24小時即12。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強。　　平板克隆形成試驗　　基本步驟：　　(1)取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。一般分每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻?！　?3)經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘?！　?4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)?！　　　?克隆數(shù)　　 克隆形成率= —————100% 　　 接種細(xì)胞數(shù)　　　　平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。試驗成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度?！　≤洯傊囵B(yǎng)克隆形成試驗　　基本步驟：　　(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1106細(xì)胞/L?！　?2)%%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固?！　?4)按1:%的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，充分混勻，%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。　　(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)?！　≤洯傊囵B(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細(xì)胞?！　　　〉谖骞?jié) 細(xì)胞化學(xué)檢測法　　　　一、四唑鹽(MTT)比色法　　檢測細(xì)胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色試驗(MTT)。此法的主要原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比?！　』静襟E：　?。?）%胰蛋白酶消化細(xì)胞使其成為單細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成1109細(xì)胞/L的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL?！　?3)培養(yǎng)3～5天后，每孔加入MTT溶液(將MTT按5mg/，輕輕吹打至全部溶解，過濾除菌，4℃避光保存，保存時間一般不超過兩周)10μL，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3～6小時，終止培養(yǎng)，加10%SDSHCl 100μL/孔37176?！　。?）用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值(OD)，選波長490nm?！　∮么朔y細(xì)胞活力，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好在試驗前測定每種細(xì)胞的貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，再確定每孔細(xì)胞接種數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止時不至過滿?！　《?、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定法(考馬斯亮藍測定法)　　此法基本原理是：考馬斯亮藍在酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合，在595nm波長處呈最大吸收，其光吸收值與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。　　基本步驟：　?。?）%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成懸液，用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1104細(xì)胞/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，置37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)一定時間?！　。?），放置10分鐘。以溶劑為空白對照，以已知量的牛血清蛋白蛋白（BSA1～50μg）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。　　三、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的3H亮氨酸摻入試驗　　此法的基本原理是，細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)時需攝取外源性氨基酸，用同位素標(biāo)記氨基酸如3H亮氨酸可以摻入細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝中，通過測定細(xì)胞的放射性強度，可了解細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝狀況?！　。?）將培養(yǎng)板置37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，每孔加100μL預(yù)溫37℃的3H亮氨酸(108Bq/mL)?！　。?）終止培養(yǎng)，取出培養(yǎng)板，小心吸出培養(yǎng)上清液，用預(yù)冷的PBS小心洗滌，晾干?！　。?）把培養(yǎng)板放在冰蓋上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分鐘，吸取上清液?！　。?） ，1% SDS,室溫下放置30分鐘。　　對懸浮生長的細(xì)胞則采用離心法處理。用同位素3H標(biāo)記TdR即3HTdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細(xì)胞的放射性強度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖情況?！　。?）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時左右?！　。?）繼續(xù)培養(yǎng)1～24小時(根據(jù)實驗要求確定)。如果細(xì)胞松散，應(yīng)先用甲醇固定10分鐘?！　。?） ,在60℃處理30分鐘，然后使之冷至室溫。　　(二)流式細(xì)胞儀測定DNA合成　　用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞增殖同期和DNA合成是90年代發(fā)展起來的新手段，不僅快速、準(zhǔn)確、效果好，而且消除同位素標(biāo)記的許多繁瑣方法和放射性污染?！　。?）進行流式儀檢測?！　　　〉诹?jié) 電 鏡 觀 察 法　　　　電子顯微鏡的誕生和發(fā)展大大推動了人們對微觀世界的研究。離體培養(yǎng)細(xì)胞具有活力好、層次薄和易于取材、固定效果好等優(yōu)點，非常適宜于電鏡觀察。　　一、透射電鏡細(xì)胞樣品制備技術(shù)和觀察方法　　(一)原理　　透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)是利用陰極發(fā)射的電子，通過陽極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號，經(jīng)物鏡、中間鏡和投影鏡等多級電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬倍，最后成像在熒光屏上便可即時觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一個細(xì)胞切成100～200片)。超薄切片技術(shù)是透射電鏡觀察成功的關(guān)鍵。細(xì)胞超薄切片技術(shù)中如何把細(xì)胞完整無損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來是最大的難題?！　?二)超薄切片基本操作步驟　　取材　　(1)離心法 適用于懸浮生長細(xì)胞或單層生長細(xì)胞，欲觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞低速離心，令細(xì)胞沉于錐形離心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定?！　?固定　　 將離心管中的細(xì)胞團塊或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分鐘?！　?脫水　　 用系列丙酮在室溫下脫水。　　 70% 丙酮溶液1次，10分鐘?！　?100% 丙酮溶液3次，每次10分鐘。　　包埋　　(1)細(xì)胞團塊 吸取混合包埋劑滴2滴于2號膠囊模塊孔的底部，把細(xì)胞團塊移入膠囊底部中心，注滿混合包埋劑，放60℃烤箱烘烤2小時，使之固化成硬塊?！　⌒迚K 將包埋塊安裝在特制的夾具上，在顯微鏡下用單刃刀片修整去除表面的包埋劑，并做記號以便定位。鏡下觀察細(xì)胞圖像，確定進行超薄切片的部位，并作標(biāo)記。制備好支持膜，小心放在銅網(wǎng)上?！　‰娮尤旧河靡桓蓛襞囵B(yǎng)皿，內(nèi)放干凈的牙科石蠟片。用濾紙吸去載網(wǎng)多余的水分，置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥。片染后涼干待觀察。用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形貌特征。二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形貌有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品的立體圖像。　　(二)基本步驟　　 (1)取材 一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為58mm左右。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小時或過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10分鐘，再用4℃預(yù)冷的1% 鋨酸，在4℃固定1小時，然后用PBS浸洗2次，每次10分鐘?！　?4)干燥 以臨界干燥法最理想，但必需要有專門的儀器，當(dāng)實驗室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。樣品經(jīng)上述處理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分鐘，最后再換100%乙腈。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的空中置內(nèi)，抽低真空，一般需30～50分鐘?！　?5)樣品導(dǎo)電處理：用真空噴鍍法?！　?