包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)-閱讀頁
2025-07-29 19:26本頁面
【正文】 mol／L。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 抗原囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原 操作方法 抗原包被： mol／L。次日，傾去抗原，％吐溫一20的磷酸鹽緩沖液( mol／L，)洗滌3次，每次3 min，拍干； 加待檢血清：血清用含3％BSA的PBST1：200稀釋，每孔加入100μl，每板應(yīng)設(shè)參考陽性一孔，參考陰性三孔及PBS對照一孔。 結(jié)果判斷 在酶標(biāo)儀上讀取492 nm(OPD)或450 nm(TMB／TMBS)吸光值，以待測樣本(S)對陰性對照血清(N)的S／N≥。3000 r／min離心15 min，棄上清； 用生理鹽水洗滌紅細胞3次，同上離心。最后，％NaN3的生理鹽水配成10％細胞懸液，4℃保存。置4℃冰箱保存。 結(jié)果判斷 陰性反應(yīng)：紅細胞全部沉入孔底呈點狀，邊緣光滑； 陽性反應(yīng)：++++100％紅細胞凝集；+++75％紅細胞凝集；++50％紅細胞凝集；+25％紅細胞凝集。 PVC溥膜快速ELISA 抗原 囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原。傾去血清，用PBST連續(xù)洗8次，甩干； 加酶標(biāo)抗體：每孔加工作濃度酶標(biāo)抗體200 u1，37℃ 5 min，同上洗滌8次，再加蒸餾水洗一次，甩干： 加底物顯色：沒孔加TMB底物200 u1，反應(yīng)5 min~10 min(TMB底物溶液的制備：TMB 50 mg溶于10ml二甲基亞砜中作為母液，4℃保存。 結(jié)果判斷 參照陰性及陽性對照，用目視法判斷結(jié)果。 免疫印跡技術(shù)(Western blot，WB) 抗原膜制備 囊液粗抗原、原頭節(jié)粗抗原或特異性純化抗原進行常規(guī)SDS—PAGE凝膠電泳，分離膠濃度為15％，抗原蛋白經(jīng)SDS—PAGE電泳分離后，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將抗原膜用封閉液(3％脫脂奶粉， mol／L NaCl， mol／L TrisHCI，pH ，％吐溫20)封閉1 h后將膜裁成寬23 mm的膜條備用。若置低溫冰箱中，可長期保存。室溫振搖2 h(4℃可過夜)。 判讀結(jié)果 細粒棘球蚴特異性反應(yīng)條帶：“8 kDa、16 kDa．、2024 kDa．(AgB)和38 kDa(Ag5) 多房棘球蚴特異性反應(yīng)條帶：18 kDa(Eml8)、54 kDa(Era2)和220 kDa(EmAP) 循環(huán)抗原(circulating antigen，cAg)檢測 特異性單克隆或多克隆抗體的制備 用粗抗原或特異性抗原免疫Balb／c小鼠，按常規(guī)方法進行細胞融合、陽性細胞克隆篩選和鑒定，將分泌特異性單克隆抗體的細胞株腹腔注射小鼠，獲得單克隆抗體腹水； 用粗抗原或特異性抗原免疫兔，獲得高效價的多克隆抗體； 建立可檢測粗抗原或特異性抗原的敏感的雙抗體夾心ELISA方法； 用建立的雙抗體夾心ELISA反應(yīng)系統(tǒng)檢測血清中的cAg。 每孔加入含3％BSA的PBST。 待檢血清用上液1：2稀釋，每孔加100 u1，37℃溫育1h，洗板3次。 加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺／四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB／TMBS，藍色)底物溶液100 u1，37℃，30 min。 酶標(biāo)儀測各孔吸光值。 循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(circulating immune plex，CIC) 檢測CIC中的循環(huán)抗原 mol／％溶液，取此液100 ul加等量1：2待檢血清混合置室溫下1h后，5000 r／min離心1 h； 吸去上清液，在沉淀中加含有8 mol／L。100ul，37℃封閉1 h，洗板3次； 加入HRP標(biāo)記的工作濃度特異性單抗或多抗100ul，37℃下1h后洗板3次； 加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺／四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB／TMBS，藍色)底物溶液100 ul，37℃，30 min。 檢測CIC ； mol／L，每孔100 ul，4℃過夜后用PBST洗板3次； 每孔加入含3％BSA的PBS39。 加入2 mol／LH2SO4 50 u1終止反應(yīng)； 酶標(biāo)儀測各孔吸光值； 對照設(shè)置和結(jié)果判定：每板設(shè)陽性對照一孔(人工復(fù)合物)，陰性血清對照三孔，以陰性對照OD均值+3SD或S／N≥。組織學(xué)檢查可見囊壁分為兩層，外層為角皮層，內(nèi)層為生發(fā)層，生發(fā)層向內(nèi)長出許多原頭節(jié)或生發(fā)囊。肉眼即可識別棘球蚴囊壁和子囊，但仍應(yīng)進行組織學(xué)檢查。最好將痰液稀釋后離心，取沉渣鏡檢。 多房棘球蚴 典型的多房棘球蚴是由無數(shù)直徑小于11mm至30mm的不規(guī)則的囊組成泡狀結(jié)構(gòu)。顯微鏡檢查，可見較薄的PAS陽性的角皮層，生發(fā)層常不易辨認。泡球蚴的內(nèi)部為壞死組織區(qū)，外部有組織細胞和淋巴細胞浸潤。由于組織纖維化使泡球蚴變得致
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