【正文】 照。 3）將接種了待鑒定菌株的試管和空白對(duì)照試管置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 h左右，如明膠凝成固體狀態(tài)，說明不液化，如試管有液體出現(xiàn)，說明明膠己被液化。 淀粉水解許多細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶，能水解培養(yǎng)基中的淀粉為無色糊精等小分子物質(zhì)，或進(jìn)一步水解為麥芽糖或葡萄糖。具體方法如下：1）將剛滅菌的已溶化的淀粉培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，無菌操作制成6個(gè)平板。（每種菌接兩個(gè)平板，剩余兩個(gè)作為空白對(duì)照） 3）將接種了待鑒定菌株的平板和空白對(duì)照平板倒置在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將平板打開蓋子，滴入少量LUGOL’S碘液于平皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱，即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。 2）將待鑒定的菌株接種在液面外一段濾紙條上，另留兩管作為空白對(duì)照。 4）第5 d觀察結(jié)果。 硝酸鹽還原某些細(xì)菌能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨和氮等。方法如下：1）將剛滅菌的硝酸鹽還原培養(yǎng)基放置于無菌操作臺(tái)冷卻。 3）將接種了待鑒定菌株的試管和空白對(duì)照試管放置于大小適宜的燒杯中固定。 4）培養(yǎng)7 d和14 d，分別測(cè)定硝酸鹽還原的情況。如無紅色出現(xiàn)，可滴加12滴二苯胺試劑，此時(shí)，如成藍(lán)色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)基仍有硝酸鹽，為陰性反應(yīng)；如不成藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和新生成的亞硝酸鹽都已還原成其它物質(zhì)，仍按陽性處理。 2）將待鑒定的菌株接種于各個(gè)不同碳源試管中，另留兩管作為空白對(duì)照。置于30 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)。如菌種能在加該碳源的試管中生長(zhǎng)，則表示該菌株能利用這種碳源，如果菌株不生長(zhǎng)，與對(duì)照試管相同，則表示菌株不利用該碳源。 2）將待鑒定的菌株在斜面上劃線接種，剩余兩管作為空白對(duì)照。 4）培養(yǎng)37 d后觀察，培養(yǎng)基被染成褐色或黑色即說明該菌產(chǎn)生黑色素。硫化氫遇鐵鹽會(huì)形成黑色沉淀物。 2）將待鑒定的菌株穿刺接種于試管中，剩余兩管作為空白對(duì)照。 4）培養(yǎng)24 d后觀察，產(chǎn)生黑色素則表明該菌株產(chǎn)生硫化氫。3 結(jié)果與討論 初篩選得到的各菌株的菌落形態(tài)特征描述： 初篩后各菌株的菌落形態(tài)菌株菌落顏色菌落邊緣表面特征水解圈描述紙綠先期黃色 后期綠色不整齊，齒狀表面光滑明顯江白白色不整齊，齒狀表面光滑明顯江長(zhǎng)毛乳白色 背面黃色不整齊，齒狀表面光滑明顯江短毛乳白色 背面紅色不整齊，齒狀表面光滑明顯瘤黑黑色不整齊，齒狀表面光滑明顯江土正面帶黃色的白色 背面顯紅色不整齊，齒狀表面光滑明顯 復(fù)篩獲得的菌株菌種分類鑒定結(jié)果 (1)紙綠 ：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，菌落初為白色絮狀，繼而轉(zhuǎn)為淺綠色，后變?yōu)樯罹G色。在斜面上為葡萄白色氣生菌絲，其邊緣和末端為淺綠或深綠色的產(chǎn)孢子區(qū)。分生孢子呈橢圓形或卵圓形，光面有小疣狀突出。 菌株在顯微鏡中的形態(tài)：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 紙綠在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況(2)江土：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，菌落為帶黃色的白色，背面顯血紅色。 江土菌株在顯微鏡中的形態(tài)：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 江土在PDA培養(yǎng)基上（正面）生長(zhǎng)情況 江土在PDA培養(yǎng)基上（反面）生長(zhǎng)情況(3)瘤黑：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，菌落顯黑色，孢子黑色，后期孢子很多，很干燥，生長(zhǎng)旺盛。菌絲發(fā)達(dá)多分枝。據(jù)此鑒定為黑曲霉。 瘤黑菌株在顯微鏡中的形態(tài)：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 瘤黑在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況(4)江長(zhǎng)毛：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，乳白色，棉絮狀，在CMC培養(yǎng)基上毛長(zhǎng)的非常長(zhǎng)，覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，菌絲很明顯，背面黃色。, , 。, , 。菌落呈平面擴(kuò)散，生長(zhǎng)快，扁平，乳白色，短絨狀或近于粉狀，有同心圈可放 射線，中心突起。在葡萄糖、甘露糖、果糖上能微弱發(fā)酵，能分解果膠。：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液，利用DNS法分別對(duì)它們?cè)?40nm下進(jìn)行了吸光度測(cè)量，： 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線其中葡萄糖量由公式y(tǒng) = = y/，x即為葡萄糖量，單位mg/ml。在CMC培養(yǎng)基中，紙綠這種菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，江白菌株產(chǎn)酶能力次之，最弱的是瘤黑。在FPA培養(yǎng)基中，所有菌株的產(chǎn)酶能力差距不是十分明顯，但總的來說江白的產(chǎn)酶能力依然最強(qiáng)。 菌株的生理生化特征 明膠液化，淀粉水解，硝酸還原，硫化氫產(chǎn)生菌株紙綠江白江土江長(zhǎng)毛江短毛瘤黑明膠液化是是是是 是是淀粉水解否否否是是是硝酸還原是是是是是是硫化氫產(chǎn)生是否否是否否 碳源利用菌株紙綠江白江土江長(zhǎng)毛江短毛瘤黑葡萄糖是是是是是是蔗糖是是是是是是木糖是否是是是是D甘露糖是是否是是否L肌醇否否是是是否L阿拉伯糖是否是是是是鼠李糖是否是是是是 討論 (1)通過生理生化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)江長(zhǎng)毛，江短毛可以利用所有的碳源，紙綠不可以利用L肌醇；江土不能利用D甘露醇；瘤黑不能利用D甘露醇，L肌醇；江白僅能利用葡萄糖，蔗糖，D甘露醇。(2)由于幾乎所有的真菌類鑒定均采用18rsDNA鑒定，僅僅利用形態(tài)學(xué)以及生理生化鑒定的文獻(xiàn)少之又少，這個(gè)鑒定帶來了很大的困難。其他三種尚且不能做出鑒定。(2)通過本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)初篩不需要稀釋后再純化接種，可以直接稀釋后直接劃線接種于培養(yǎng)基上，且長(zhǎng)勢(shì)良好。(4)由于瘤胃中篩得的菌株應(yīng)該是厭氧菌，而不應(yīng)該是好氧的黑曲霉，所以可能是意外所得。M,Lee, . 1988, 255: 898899.[7] 張樹政主編，酶制劑工業(yè)，科學(xué)出版社，北京,1984.[8] M．P．Coughlan著，[J]. 國(guó)外畜牧科學(xué), 1991, 18(6), 2831.[9] 袁勤生現(xiàn)代酶學(xué), 第一版. 上海：華東理工大學(xué)出版社, 2001.[10] 張壯志. 高效纖維素分解菌的篩選、鑒定及其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶活性的研究[D]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009, 7~13[11] Toyama H. Construction of cellulase hype producers of Trichoderma reesei Rut C30 for utilization of waste paper using colchicines and buxomly[J]．Journal of Molecular Catalysis B: Enzymic, 2002, 17(3/5): 175~178.[12] 韓峰，孫彩云，宋小焱．?dāng)M康氏木霉UVIII纖維素酶合成的誘導(dǎo)與阻遏[J]. 工業(yè)微生物, 2003, 33(1): 23~26.[13] PRABAVATHY V R,MATHIVANAN N, SAGADEVAN E．Intra strain protoplasfusion enhances carboxymethyl cellulase activity in Trichoderma reesei[J]. Enzyme and Microbial Technology,2006, 38(5)：719—723．[14] 張壯志. 高效纖維素分解菌的篩選、鑒定及其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶活性的研究[D]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009.[15] 高倫江, 董全, 唐春紅. 纖維素酶的研究進(jìn)展及前景展望[J]. 江蘇食品與發(fā)酵, 2007(4): 6~9.[16] 崔宗均, 李美丹, 樸哲, 黃志勇. 一組高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系MCI的篩選及功能[J].環(huán)境科學(xué)，2002, 23(3)：36~139. [17] 韓紹印, 席宇, 翁海波, 朱大恒, 高建民, 楊德梁等. 一株高環(huán)境適應(yīng)性纖維素降解菌的篩選及鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007(12): 51~54[18] 張紀(jì)中主編. 微生物分類學(xué)[M]. 上海, 復(fù)旦大學(xué)出版社, 1990 [19] 文成敬, 陶家鳳, 陳文瑞. 中國(guó)西南地區(qū)木霉屬分類研究[N].真菌學(xué)報(bào), 12(2): 118~130,1993.致 謝本文從選題的確定，論文的寫作、修改到最后定稿得到了我最敬愛的老師楊忠華老師的悉心指導(dǎo)。楊忠華老師對(duì)我們的嚴(yán)格要求體現(xiàn)了他作為一名老師的高度責(zé)任心，同時(shí)也使我深深受益，在實(shí)驗(yàn)室每天的簽到工作使我慢慢改掉了以前的惰性，剛開始時(shí)我偶爾遲到，可后來幾乎沒有遲到過，讓我有了更強(qiáng)的時(shí)間觀念。在楊忠華老師的諄諄教導(dǎo)下，通過這次本科畢業(yè)實(shí)驗(yàn)，我的學(xué)習(xí)和生活態(tài)度有了很大的轉(zhuǎn)變，我的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作能力都有了很大的提升，這將對(duì)自己以后的學(xué)習(xí)和生活大有裨益。特別要感謝趙燕師姐，從查文獻(xiàn)，開題到做實(shí)驗(yàn)，從修改翻譯到寫論文她都給了我巨大的幫助，而我不辜負(fù)她的希望最終順利的完成了任務(wù)。同時(shí),也要感謝在論文寫作過程中，幫助過我、并且共同奮斗四年的大學(xué)同學(xué)們，能夠順利完成論文，是因?yàn)橐宦飞嫌心銈兊膸椭?，再次衷心地感謝所有在我論文寫作過程中給予過我?guī)椭娜藗?，謝謝你們！