【正文】 高活性玉米蛋白酶解物，又能確定最優(yōu)工藝條件的目的。在不同的溫度水平下，玉米蛋白酶解物 DH 隨著 pH 的增加先增加后減少，在溫度接近于1 水平時，DH 隨[E]/[S] 的增加逐漸減小，在[E]/[S] 接近于1 時，DH 隨 pH 的增加先增加后減少，可見 pH 在交互作用中影響較為顯著。響應(yīng)面結(jié)果具有較好的擬合度，可以用于預(yù)測 DH 的變化。 %。為了滿足制備酶解液的要求，選用過篩后的玉米蛋白粉進(jìn)行實驗，能夠提高酶解效果 [57]。制備生物活性肽的蛋白酶具有很強(qiáng)的專一性，酶解產(chǎn)物的抗氧化性與酶種類、酶解環(huán)境和水解程度有直接關(guān)系 [59]。本實驗結(jié)果顯示，堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物無論在水解度還是抗氧化指標(biāo)上，均優(yōu)于其他兩種蛋白酶。各種酶催化反應(yīng)都需要有最適溫度，在最適溫度下，單位時間內(nèi)酶與底物分子間的有效接觸次數(shù)最多，酶的親和力最強(qiáng)。pH 值對酶的影響主要表現(xiàn)為對酶活性部位的作用。電子束輻照在食品加工中的應(yīng)用主要是消毒和滅菌 [45]，用于蛋白質(zhì)酶解實為首次。莫耽研究了輻照處理對大豆分離蛋白分子性狀的影響，證明輻照能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增大輻照劑量可導(dǎo)致蛋白乳化性下降 [49]。掃描電鏡實驗為輻照處理對玉米蛋白粉的作用方式提供了依據(jù)。而且在輻照劑量較高時，樣品表面完整性明顯降低，緊密結(jié)構(gòu)被打開，表面積增加。掃描電鏡結(jié)果輔助解釋了輻照加工提高玉米蛋白水解度的作用原理。通過對酶解溫度 T、酶解 pH 值、酶比底物濃度[E]/[S]的單因素實驗對比分析獲知，堿性蛋白酶酶解制備玉米蛋白粉酶解物的 DH 最高。 %。 %，經(jīng)場發(fā)射掃描電鏡檢測輻照前后玉米蛋白粉表面形態(tài)變化，獲知較未輻照玉米蛋白粉相比，輻照劑量為 kGy 的玉米蛋白粉表面的凹凸程度增加，完整性下降。第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究18第 6 章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究在基于高壓脈沖電場技術(shù)（PEF）提高玉米抗氧化肽活性的研究中，將以 CAPS2 和蛋清抗氧化肽（EWAPS）為實驗原料，以 DPPH 清除率為衡量指標(biāo)，將借助單因素和響應(yīng)面實驗設(shè)計方法，考察料液濃度、電場強(qiáng)度和電場頻率對 CAPS2 抗氧化活性的影響，構(gòu)建 PEF 技術(shù)提高 CAPS2 抗氧化活性的工程化回歸模型，試圖獲得最佳工藝參數(shù)，并利用中紅外分析（MIR）對電場處理前后的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較。 儀器與設(shè)備LDT200/ PEF 系統(tǒng)：長春華迪生物科技開發(fā)有限公司；ZG2 真空冷凍干燥機(jī)：杭州創(chuàng)意真空冷凍干燥設(shè)備廠；單道移液器（200 μL，1000 μL ）：北京東林昌盛生物科技有限公司；MH2 型微量振蕩器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；RT6000 酶標(biāo)儀：美國雷杜公司；IR Prestige21 紅外光譜儀：日本島津公司。開啟電場裝置電源，將電場強(qiáng)度和電場頻率設(shè)至所需參數(shù)，PEF 處理時間為 23 min，收集處理液放置于 4 ℃冰箱中備用。檢測料液濃度對 DPPH清除率的影響時，三個水平分別為 6 mg/mL，8 mg/mL 和 10 mg/mL，恒定條件為：電場強(qiáng)度 10 kV/cm，電場頻率 2022 Hz；檢測電場強(qiáng)度對 DPPH 清除率的影響時，三個水平為 5 kV/cm，10 kV/cm 和 15 kV/cm，恒定條件為：料液濃度 10 mg/mL，電場頻率 2022 Hz；檢測電場頻率對 DPPH 清除率的影響時，三個水平為 2022 Hz，2350 Hz 和 2700 Hz，恒定條件為：料液濃度 10 mg/mL，電場強(qiáng)度 10 kV/cm。表 因素水平設(shè)計表Table Design of variabls and levels水平因素1 2 3料液濃度（mg/mL） 6 8 10電場強(qiáng)度（kV/cm ） 5 10 15電場頻率（Hz） 2022 2350 2700 響應(yīng)面實驗設(shè)計利用響應(yīng)面軟件 DesignExpert 中的 BBD 實驗設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化分析，根據(jù)單因素實驗結(jié)果和 BBD 中心組合實驗原理， 利用 DesignExpert 軟件 BBD 模型選定三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計 [87]，自變量 X1（料液濃度）、 X2（電場強(qiáng)度）、X 3（電場頻率）的三因素三水平編碼表如表 ：表 響應(yīng)面因素水平編碼表Table Factors and levels design of RSM編碼水平因素1 0 1料液濃度（mg/mL） 6 8 10電場強(qiáng)度（kV/cm ） 5 10 15電場頻率（Hz） 2022 2350 2700第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究20 DPPH 清除率的測定方法將 PEF 處理后的 CAPS2 和 EWAPS 處理液進(jìn)行真空冷凍干燥，收集凍干粉以供檢測 DPPH 清除率，檢測方法同 。將溴化鉀在 130 ℃下干燥 58 h，以備壓片。 數(shù)據(jù)處理與分析方法每個樣品設(shè)三個平行，利用 SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果均用平均數(shù)177。 .）表示，利用 DesignExpert 軟件中的 BBD 分析響應(yīng)面實驗的二次多項式模型的回歸系數(shù)和響應(yīng)值，顯著性水平為 P。 %，當(dāng)濃度增至 10 mg/mL 時，DPPH 清除率顯著降低（P） ；由圖 （ b）可知，當(dāng)電場強(qiáng)度由 0 kV/cm 增至 5 kV/cm 時，CAPS2 的DPPH 清除率顯著增加（ P） ，并達(dá)到最高值 177。 %。經(jīng)比較獲知，CAPS2 的 DPPH 清除率較高于 EWAPS 的 DPPH 清除率。第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究22 PEF 的響應(yīng)面實驗結(jié)果以 DPPH 清除率為衡量指標(biāo)，考察料液濃度、電場強(qiáng)度和電場頻率對其影響情況，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實驗設(shè)計，結(jié)果如表 所示。表 響應(yīng)面實驗優(yōu)化結(jié)果 Table Results of RSM optimization DPPH 清除率（%）序號 X1 X2 X3 實測值 預(yù)測值1 0 1 1 177。 3 0 0 0 177。 5 0 1 1 177。 7 1 1 0 177。 9 1 1 0 177。 11 1 0 1 177。 13 1 1 0 177。 15 1 0 1 177。第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究23表 回歸模型方差分析結(jié)果Table Results of variance of regression model變異來源 平方和 均方 F 值 P 值 ProbFModel X1 X2 X3 X12 X22 X32 X1 X2 X1 X3 X2 X3 Residual Lack of fit Corr. total 注：R=。 adjusted R2=。 adequate. precision= P。在料液濃度接近1 水平時，CAPS2 的 DPPH 清除率隨著電場強(qiáng)度的增加先增加后減少；在料液濃度接近于1 水平時，CAPS2 的 DPPH 清除率隨電場頻率的增加先增加再減少；在電場強(qiáng)度接近于 0 水平時，CAPS2 的 DPPH 清除率隨電場頻率的增加先增加后減少。（3）響應(yīng)面實驗最優(yōu)工藝參數(shù)通過對 DesignExpert 軟件構(gòu)建的回歸模型求偏導(dǎo)，獲得 PEF 處理技術(shù)提高CAPS2 的 DPPH 清除率的最佳工藝參數(shù)：料液濃度 6 mg/mL，電場強(qiáng)度 kV/cm，電場頻率 Hz，在此條件下 CAPS2 的 DPPH 清除率為 177。第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究24（a）料液濃度與電場強(qiáng)度的交互作用（b）料液濃度與電場頻率的交互作用（c）電場強(qiáng)度與電場頻率的交互作用圖 DPPH 清除率的響應(yīng)面等高線圖和 3D 圖Figure RSM contours and 3D plots of DPPH inhibition第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究25 MIR 分析結(jié)果CAPS2 的 MIR 分析結(jié)果如圖 所示，在波數(shù)范圍為 37003200 cm1 時，經(jīng) PEF 處理的 CAPS2 的吸收值大于未處理樣品，在波數(shù)范圍為 27502300 cm1 時，經(jīng) PEF 處理的 CAPS2 的吸收值低于未處理樣品，其他波數(shù)范圍內(nèi)，PEF 處理前后的 CAPS2 的吸收值無明顯差異。 討論實驗結(jié)果顯示，PEF 處理能夠顯著提高 CAPS2 的 DPPH 清除率，在前期研究基礎(chǔ)上 [64]，將 PEF 處理對 EWAPS 的 DPPH 清除率的影響情況做對照，研究發(fā)現(xiàn)：PEF 處理能夠顯著提高二者抗氧化活性，各因素作用于二者抗氧化活性的的變化趨勢相同，最優(yōu)條件也相同，且 CAPS2 的抗氧化活性更好。有研究證實，高壓脈沖電場能夠改變食品成分特性 [91,92]，PEF 通過改變強(qiáng)度可以導(dǎo)致蛋白分子的極化，打破分子內(nèi)部的共價鍵作用力，加強(qiáng)蛋白分子和溶劑的親和力，從而提高溶解度 [93,94]。在強(qiáng)電場作用下，能改變分子間電性作用力，導(dǎo)致電荷分離造成大分子的重新定位或變第 6章 基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究26形，并導(dǎo)致復(fù)合體空間構(gòu)象的改變，從而引起共價鍵斷裂或分子作用力的減弱 [64]。而料液濃度的不同導(dǎo)致了物質(zhì)內(nèi)部液體含量的不同，造成介電常數(shù)改變，最終反映為處理所產(chǎn)生的電解產(chǎn)物更易穿透細(xì)胞膜與活性肽段結(jié)合，從而改變 CAPS2 的活性。 本章小結(jié)（1）在基于高壓脈沖電場技術(shù)（PEF）提高玉米抗氧化肽活性的研究中，以 CAPS2 和 EWAPS 為實驗原料，以 DPPH 清除率為衡量指標(biāo)，借助單因素和響應(yīng)面實驗設(shè)計方法，構(gòu)建了 PEF 技術(shù)提高 CAPS2 抗氧化活性的工程化回歸模型為 Y=++++ X32，式中 X1 為料液濃度（mg/mL）、X 2 為電場強(qiáng)度（kV/cm）、X 3 為電場頻率（Hz）；最佳技術(shù)參數(shù)為：料液濃度 6 mg/mL、電場強(qiáng)度 kV/cm、電場頻率 Hz，此條件下 PEF 處理的 CAPS2 的 DPPH 清除率可達(dá)到 177。（2）借助 MIR 分析手段，對 PEF 處理前后的 CAPS2 進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較，研究發(fā)現(xiàn)：波數(shù)范圍為 37003200 cm1 時，PEF 處理樣品的吸收值大于未處理樣品，在波數(shù)范圍為27502300 cm1 時，PEF 處理樣品的吸收值低于未處理樣品。第 7章 結(jié)論27第 7 章 結(jié)論 全文結(jié)論本文研究了玉米蛋白源高效酶解制備抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)，借助可控酶解，電子束輻照加工，分離純化和體內(nèi)體外抗氧化活性評價等實驗技術(shù)，研究了玉米抗氧化肽的高效制備、活性組分優(yōu)選和安全毒理學(xué)評價，探討了高壓脈沖電場技術(shù)對玉米抗氧化肽的活性提高作用。綜合分析篩選出堿性蛋白酶為高效酶解蛋白酶。其最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度 50 ℃，酶解 pH 值 ，酶比底物濃度 %，此條件下玉米蛋白粉的 DH 為 177。在此研究基礎(chǔ)上，考察了電子束輻照加工處理對玉米蛋白粉 DH 的影響，通過 DH單因素實驗優(yōu)選出最佳輻照劑量為 kGy，此條件處理的玉米蛋白粉 DH 可達(dá) 177。經(jīng)場發(fā)射電子掃描檢測輻照前后玉米蛋白粉的表面形態(tài)變化獲知，較未輻照的玉米蛋白粉相比，輻照劑量為 kGy 的玉米蛋白粉表面的凹凸程度增加，完整性下降，表面積增大。結(jié)果表明 CAPS1 的DPPH 清除率可達(dá)最高值 177。以五種不同分子量范圍的超濾液為研究對象，借助受試小鼠血清中的 GSHPx 活力、CAT 活力和 MDA 含量為衡量指標(biāo)，進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性評價。 U/mL； CAPS1MD 組的 CAT 活力顯著增加（P） ，可達(dá)最高值 177。 U/mL。（3）高活性玉米抗氧化肽（CAPS1）的安全毒理學(xué)評價研究以超濾分離獲得的 CAPS1 為實驗原料，以受試小鼠的精子畸形率、骨髓微核率、NK 細(xì)胞活性、臟器系數(shù)（心臟系數(shù)、肺系數(shù)、腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、胸腺系數(shù)）和體重均值為衡量指標(biāo)，結(jié)果表明，與對照組相比，CAPS1 對受試小鼠的精子畸形率、骨髓微核率、臟器系數(shù)（心臟系數(shù)、肺系數(shù)、腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、胸腺系數(shù)）和體重均值的影響均不顯著（P） ；對受試小鼠的 NK 細(xì)胞活性顯著提高（P ） ，最高可達(dá)177。（4）玉米抗氧化肽（CAPS1）分離制備高活性因子的研究以 CAPS1 為實驗原料，以 DPPH 清除率為衡量指標(biāo)，利用 Sephadex G25 凝膠色譜分離技術(shù)為分離純化方法，當(dāng) Sephadex G25 凝膠色譜分離裝置的層析柱徑高比為:100、上樣濃度為 50 mg/mL、洗脫流速為 60 mL/h 時，分離獲得 CAPS1Ⅰ、CAPS1Ⅱ、 CAPS1Ⅲ和 CAPS1Ⅳ 4 個組分，研究發(fā)現(xiàn) CAPS1Ⅲ的 DPPH 清除率可達(dá)最高值 177。（5）基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究以 CAPS2 和 EWAPS 為實驗原料，以 DPPH 清除率為衡量指標(biāo)，借助單因素和響應(yīng)面實驗設(shè)計方法，構(gòu)建了 PEF 技術(shù)提高 CAPS2 抗氧化活性的工程化回歸模型為 Y=++++ ，式中 X1 為料液濃度（mg/mL）、X 2 為電場強(qiáng)度（ kV