蛋白質(zhì)的基本機(jī)構(gòu)和功能-閱讀頁(yè)
2025-05-17 13:42本頁(yè)面
【正文】 蛋白質(zhì)構(gòu)象是其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)， 構(gòu)象改變功能改變。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)性質(zhì)為 電泳分離 的依據(jù)。 帶電粒子在電場(chǎng)中向 電性相反 的電極 移動(dòng) 的 現(xiàn)象。 帶電荷多，分子小的泳動(dòng)速度較快；反之則泳動(dòng) 較慢， 從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。 蛋白質(zhì)分子表面的 水化膜 和 同種電荷 。 透析 用于分離純化蛋白質(zhì) 超速離心 用于蛋白質(zhì)的分離純化及分子量的測(cè)定。 變性的實(shí)質(zhì) 次級(jí)鍵斷裂 ， 空間結(jié)構(gòu)破壞 三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固 引起變性的因素 物理因素 高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等。 變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn) ，易于沉淀 蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用 ? 應(yīng)用變性的因素進(jìn)行消毒、滅菌。 蛋白質(zhì)的復(fù)性 大多數(shù)蛋白質(zhì)變性后，空間構(gòu)象嚴(yán)重破壞，不能恢復(fù)其天然狀態(tài)，稱為不可逆性變性；若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素，有些可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性 ,稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 ? 方法 鹽析法、有機(jī)溶劑的沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，但并不都變性，如鹽析。此特性常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 ? 抗原（免疫原）： 凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。 ? 單克隆抗體： 由針對(duì) 某一個(gè)特定抗原決定簇 而分化、增殖而來(lái)的 B淋巴細(xì)胞群合成并分泌的抗體。 ? 堿性溶液中與 Cu2+產(chǎn)生藍(lán)色， mg級(jí)測(cè)定 2. 茚三酮反應(yīng) : ? 酸性條件下，與茚三酮共熱產(chǎn)生藍(lán)紫色 3. Folin— 酚試劑反應(yīng) ? 堿性 +Cu2++磷鉬酸 磷鎢酸 → 藍(lán)色 ? 范圍 :25250μg(Tyr,Trp的反應(yīng) ) 1. 紫外分光光度法 : ? 280nm, ? (樣品含核酸時(shí) )蛋白質(zhì) (mg/ml)= 2. 福林 酚試劑法 : ? 堿性 +Cu2++磷鉬酸 磷鎢酸 → 藍(lán)色 ? 范圍 :25250μg(Tyr,Trp的反應(yīng) ) 七、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 3. Biuret法： ? 蛋白質(zhì) +堿性 +Cu2++BCA試劑 (4,4‘二羧酸 2,2’二喹啉鈉 )→ 紫色 (562nm) ? 范圍 :101200μg/ml 4. Bradford蛋白分析法 : ? 考馬斯亮藍(lán) G250+乙醇 +酸性 → 淡紅色 +蛋白質(zhì) →藍(lán)色 (595nm) ? 范圍 :10100μg/ml ? 肽鍵 +堿性 +Cu2+→ 紫紅色 ? 范圍 : ? 1g氮相當(dāng)于樣品含有 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化 一、蛋白質(zhì)的提取 1. 選材： 新鮮、富含目的蛋白且來(lái)源方便 2. 組織細(xì)胞的粉碎： 胞內(nèi)及膜中蛋白 ? 物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等 ? 化學(xué)法：如 EDTA、 SDS等 ? 酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等） 3. 提取： 適當(dāng)溶媒、適當(dāng)條件、適當(dāng)提取時(shí)間和次數(shù) 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （一）根據(jù)溶解度不同 1. 等電點(diǎn)沉淀 :蛋白質(zhì)在 pI時(shí)溶解度最小 2. 鹽析 (分級(jí) ):大量中性鹽如 (NH4)2SONa2SO NaCl加入蛋白質(zhì)溶液中 ,破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀 .各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)需鹽濃度及 pH不同 . 3. 低溫有機(jī)溶劑沉淀 (分級(jí) ):降低水的介電常數(shù) （二）根據(jù)分子大小不同 1. 透析和超濾 (分級(jí) ):根據(jù)分子量的大小，用透析袋或?yàn)V膜將大、小分子物質(zhì)分開 2. 凝膠過(guò)濾 (分子排阻層析 ):又稱分子篩，柱內(nèi)填滿帶有小孔的顆粒，一般為葡聚糖 3. 密度梯度離心 :根據(jù)粒子密度差進(jìn)行
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