【正文】 與此相偶聯(lián)的生物合成酶活性的供體 ? 以 E. coli作為合成酶活性的受體菌和具有較強 ATP生物合成活性的產(chǎn)氨短桿菌或面包酵母組合而成的種間耦合反應(yīng)系統(tǒng) ATP再生系統(tǒng) ? （ 1） GMP(539。三磷酸鈉鹽 )生產(chǎn)過程 ? 葡萄糖 → PRPP(磷酸核糖焦磷酸 ) ? 腺嘌呤＋ PRPP→AMP ＋ Ppi ? 產(chǎn)氨短桿菌同時具有 PRPP(磷酸核糖焦磷酸 )生物合成活性與 ATP生物合成活性 ， 可利用腺嘌呤為前體生產(chǎn)ATP ? (3) GSH(谷胱甘肽 )的生產(chǎn)過程 ? Glu＋ Cys＋ ATP→ ?GC(?谷氨酰半胱氨酸 ) ? ?GC＋ Gly＋ ATP→GSH ＋ ADP＋ Pi ? 谷胱苷肽的生物合成過程 葡萄糖6 －磷酸葡萄糖6 －磷酸果糖1 , 6 －二磷酸果糖磷酸二羥丙酮 3 －磷酸甘油醛1 , 3 －二磷酸甘油酸3 －磷酸甘油酸2 －磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸E M P乙醛 乙醇谷氨酸γ －谷氨酰半胱氨酸甘氨酸半胱氨酸谷胱甘肽A T P A T PA D P A D PG S H Ⅰ G S H Ⅱ 5. 種間耦合 ATP再生系統(tǒng) ? （ 1） IMP(539。 但當(dāng)細(xì)胞用作酶源時 ， 這種屏障就會阻礙底物和產(chǎn)物進出細(xì)胞 7. 解決 ATP再生系統(tǒng)存在問題的辦法 ? ( 1) 抑制副反應(yīng)的方法 ? 對于具有分解 、 轉(zhuǎn)移底物或產(chǎn)物為副產(chǎn)物的酶 ， 可通過選育缺失該酶活性的突變株 ， 或優(yōu)化反應(yīng)條件使副產(chǎn)物的形成降低到最小的限度 ? ( 2) 提高膜通透性的方法 ? 干燥細(xì)胞或用溶劑 、 表面活性劑處理細(xì)胞都可以提高細(xì)胞膜的通透性 ? （ 3）固定化微生物細(xì)胞的方法 ? 該法具有以下優(yōu)勢 ∶ ①不需要提取和純化酶的過程；②細(xì)胞可以重復(fù)使用；③可以實現(xiàn)連續(xù)操作；④反應(yīng)器占地??；⑤反應(yīng)控制容易；⑥要處理的液體體積?。虎呖梢垣@得高純度產(chǎn)品；⑨工廠污染減輕 ? 缺點：固定化操作較為繁瑣 ? 研究由固定化細(xì)胞組成的 ATP再生系統(tǒng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的過程，仍是這一領(lǐng)域今后的發(fā)展方向 三 . 有機廢水處理和聚羥基烷酸生產(chǎn)的耦合系統(tǒng) ? 工合成塑料污染的主要特點是 ∶ ? (1)污染范圍廣 。 全世界每年對塑料的需求量為 1億噸 。 塑料具有耐酸堿 、 抗氧化 、 難腐蝕 、 難降解的特性 ， 埋地處理百年不爛；燃燒時產(chǎn)生大量有毒氣體 ，如 HCl、 硫氧化物 、 碳氧化物等 ? (4)回收利用難 。 地膜降低耕地質(zhì)量 ， 農(nóng)作物植株矮小 ， 抗病力差；殘膜隨風(fēng)飄動 ， 對周圍環(huán)境 、 畜牧業(yè) 、 養(yǎng)殖業(yè)都有很大的影響 生物可降解塑料的特點： ? 聚羥基烷酸酯 (Polyhydroxyalkoates，簡稱 PHAs)是生物可降解材料的一個研究熱點。已有研究表明，采用 PHAs制作的香波瓶，在自然環(huán)境中 9個月后，可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同樣物品，完全降解的時間約需 100年 有機廢水的資源化處理 ? 有機廢水是地球環(huán)境的一大污染源 ， 但同時也是一種資源 ， 近幾十年來 ， 有機廢水的資源化技術(shù)發(fā)展極其迅速 ， 已被認(rèn)為是消除有機廢水污染的最經(jīng)濟有效的途徑之一 ? 用于高濃度有機廢水處理的厭氧消化技術(shù) ， 自 20世紀(jì)50年代以后得到了迅速發(fā)展 ， 先后出現(xiàn)了厭氧濾池(AF)、 上流式厭氧污泥床反應(yīng)器 (UASB)、 附著膜厭氧膨脹床反應(yīng)器 (AAFEB)、 厭氧流化床反應(yīng)器等 ， 其中UASB的應(yīng)用最為廣泛 ? 該反應(yīng)器能培養(yǎng)并保持大量活性高 、 沉降性能好的顆粒污泥 ， 因而反應(yīng)器的處理能力大大提高 ， 水力停留時間大大縮短 有機廢水的厭氧處理 ? 有機廢水的厭氧發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的有多種微生物類群參加的生物化學(xué)過程，通?？煞譃樗嵝园l(fā)酵階段 (產(chǎn)酸 )和甲烷化階段 (產(chǎn)甲烷 )兩階段 ? 產(chǎn)酸階段主要是有機廢水中復(fù)雜的大分子有機物在厭氧條件下被水解和產(chǎn)酸細(xì)菌發(fā)酵成為有機酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。 ? 產(chǎn)甲烷階段主要是產(chǎn)酸階段產(chǎn)生的小分子有機酸被產(chǎn)甲烷菌利用轉(zhuǎn)化為甲烷 不同研究者的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物 基質(zhì) 溫度 反應(yīng)器 酸化相優(yōu)勢產(chǎn)物 研究者葡萄糖 20 CS TR 丁酸 Coh e n糖蜜廢水 35 CS TR 丁酸 Gi l P e na葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Z oe t e m e y e r葡萄糖 35 CS TR 乙酸 Roy葡萄糖 35 U AS B 乳酸 Sh i y i L un 有機廢水處理和 PHAs生產(chǎn)耦合系統(tǒng) ? 理論依據(jù)是 ∶ ? （ 1） 有機廢水在厭氧處理過程中 ， 產(chǎn)酸微生物能將廢水中生物可降解的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿佑袡C酸 ，如乙酸 、 丙酸 、 乳酸 、 丁酸以及其它可溶性小分子化合物 ? （ 2） 真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌在好氧 、 碳源充足 、 貧氮的條件下能利用有機酸在胞內(nèi)大量積累 PHAs ? 將有機廢水酸化反應(yīng)器與 PHAs發(fā)酵罐相組合 ， 可使酸化反應(yīng)器為 R. eutrophus 提供相對穩(wěn)定 、 較佳的底物 ，從而在發(fā)酵罐中相對廉價地生產(chǎn)出 PHAs 主要內(nèi)容包括以下五個方面 ∶ 1. 有機廢水生產(chǎn) PHAs的初步條件； 2. R. eutropha發(fā)酵生產(chǎn) PHAs最佳有機酸種類的確定 ， 包括以有機酸為底物生產(chǎn) PHAs的代謝機理 、 理論產(chǎn)率和 PHAs發(fā)酵的實際產(chǎn)率； 3. 高效厭氧酸化工藝 ， 包括酸化率達 100%時有機酸分布的工藝學(xué)條件等； 4. 在小型發(fā)酵罐中 ， 以不同濃度的酸化廢水為碳源進行分批發(fā)酵實驗 ， 在對 PHAs發(fā)酵過程動力學(xué)分析的基礎(chǔ)上 ， 建立較為合理的 PHAs發(fā)酵過程動力學(xué)模型； 5. 進行了有機廢水生產(chǎn) PHAs流加發(fā)酵的初步研究 ， 比較了分批和流加發(fā)酵過程中丁酸對 PHAs產(chǎn)率的變化 有機廢水酸化和 PHAs生產(chǎn)耦合系統(tǒng) ①進水池 ②泵 ③ UASB酸化反應(yīng)器 ④出水池 ⑤分離濃縮系統(tǒng) ⑥濃縮的有機酸 ⑦ PHA發(fā)酵罐 ③④⑤⑥⑦DOpHT①② 1. 有機廢水生產(chǎn) PHAs的初步研究 ? 有機廢水生產(chǎn) PHAs是指 R. eutropha 以有機廢水厭氧酸化的產(chǎn)物為生產(chǎn) PHAs的基質(zhì) ? 在一定溫度下，影響有機廢水酸化的主要因素： ? (a) 水力停留時間 (HRT) ? (b) pH值 (進水堿度 ) 酸化階段 HRT對發(fā)酵階段 PHAs濃度的影響 中液酵發(fā)度濃HR T (h)2 4 6 8 101. 01. 21. 41. 61. 82. 0度濃中液酵發(fā)堿度 ( mg / L )4000 6000 8000 10000 120221. 01. 21. 41. 61. 82. 0進水堿度對發(fā)酵階段 PHAs濃度的影響 2. R. eutropha 利用不同有機酸生產(chǎn) PHAs 的比較研究 ? 目前研究采用的 PHAs生產(chǎn)方式通常有兩種 : ? 一種是一步發(fā)酵法，即細(xì)胞生長與 PHAs積累相偶聯(lián)； ? 另一種是兩步發(fā)酵法，即微生物生長和 PHA積累分兩階段進行，第一階段細(xì)胞大量形成，第二階段細(xì)胞基本不繁殖而 PHAs大量積累，這種方法需進行菌體的離心收集 (1) 一步發(fā)酵法生產(chǎn) PHAs 采用不同工藝對有機廢水進行厭氧酸化，可得到以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等為優(yōu)勢產(chǎn)物的酸化廢水 乙酸 丙酸 乳酸 丁酸細(xì)胞干重 / g ? L1 PHA s 濃度 / g ? L1 PHA s 含量 / % R. eutrophus WSH1對不同酸的利用 * * 初始酸濃度為 10 g/L，分別在 19h、 25h、 32h、 43h、 50h加入5 g/L的酸 (2)兩步發(fā)酵法生產(chǎn) PHAs ? 4種有機酸的初始濃度采用 10 g/L，并分別在發(fā)酵的 19 h、 h、 h和 43 h補充加入 g/L的酸?？刂撇煌峄瘲l件，可以使不同的有機酸成為主要酸化產(chǎn)物。 □ 10 g/L。 20 g/L。 用這種方法可以減輕內(nèi)部溶劑萃取中的乳化問題 164。外部隨程萃取則不存在這一問題，在外循環(huán)中多余的溶劑可用氣體抽提去除，若細(xì)胞對溶劑敏感，還可在微量溶劑回流反應(yīng)器前進行脫氣處理 2. 滲透萃取 ? 滲透萃取是一種基于膜技術(shù)的萃取系統(tǒng) ? 膜技術(shù)在萃取中具有能夠增加傳質(zhì)面積和降低乳化程度及減輕溶劑對微生物的毒害作用的優(yōu)點 ? Solichien采用氧化三辛基膦 (TOPO)與煤油的復(fù)合體系作為溶劑，由于萃取劑和培養(yǎng)液被膜隔開，萃取劑對細(xì)胞的毒性有所降低 ? 例如，在丙酸、乙酸和 乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，利用滲透萃取技術(shù)可降低產(chǎn)物對微生物的毒害作用，從而大大提高發(fā)酵水平 3. 滲透蒸發(fā) ? 滲透蒸發(fā)技術(shù)具有分離因子高、操作費用低、對膜結(jié)構(gòu)的無限制性及操作時具有較高的機械強度等優(yōu)點 ? 例如，在乙醇生產(chǎn)中，滲透蒸發(fā)是將乙醇從發(fā)酵液中連續(xù)分離的最有效手段，由于降低了產(chǎn)物抑制和分離操作費用，生產(chǎn)率得以顯著提高 ? Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纖維膜(PDMS─HF)結(jié)合氮氣作為載氣，可從水相中連續(xù)分離乙醇和異丙醇 4. 其它生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離技術(shù) ? (1) 氣體抽提 ? (2) 吸附 ? (3) 結(jié)晶 ? (4) 層析技術(shù) ? (5) 電滲析 ? (6) 動電技術(shù) ? (7) 受控底物分配 ? (8) 在酶學(xué)上的應(yīng)用 5. 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離組合系統(tǒng)的發(fā)展趨勢 ? (1) 目前的研究更加深入和細(xì)化，包括 : ? (a)有抑制或毒害作用副產(chǎn)物的選擇性分離； ? (b)選擇性地供給營養(yǎng)底物； ? (c)不可發(fā)酵底物或老齡化細(xì)胞的分離 ? (2) 新的分離技術(shù)不斷出現(xiàn)，主要體現(xiàn)在 : ? (a)新的選擇性更強、生物相容性更好的生化分離方法的開發(fā)和應(yīng)用 (如基于分子識別的分離方法 )； ? (b)將傳統(tǒng)分離技術(shù)組合使耦合系統(tǒng)的選擇性更好、效果更理想，如前面介紹的膜技術(shù) 代謝工程 一、代謝工程概述 代謝工程的基本理論及應(yīng)用策略的形成： ，經(jīng)濟、合理地利用和合成自身所需的各種物質(zhì)和能量，使細(xì)胞處于平衡生長狀態(tài)。為了大量積累某種代謝產(chǎn)物，就必須打破微生物原有的平衡狀態(tài)，這就需要對細(xì)胞的代謝途徑進行修飾。由于該工程在很大程度上依賴于傳統(tǒng)的化學(xué)誘變技術(shù)及設(shè)計精巧的選擇程序，因此手段單一，結(jié)果不盡人意。 代謝工程的第一個應(yīng)用實例： 1974年 ， Chakrabarty在假單胞菌屬的惡臭假單胞菌 （ P. putide） 和銅綠假單胞菌 （ P. aeruginosa） 中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒 ， 增加了兩者對樟腦和萘的降解催化活性 。 代謝工程的一般定義： 通過某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向改善細(xì)胞的特性或運用重組 DNA 技術(shù)來創(chuàng)造新的化合物 具體定義： 代謝工程是應(yīng)用重組 DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進行有精確目標(biāo)的基因操作，以改變微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)（酶的功能和輸送體系的功能、甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能），通過有目的地對細(xì)胞代謝進行修飾（功利性修飾）以改變細(xì)胞某些方面的代謝活性的整套工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計、遺傳操作、目的代謝獲悉功能的實現(xiàn)），從而達到實現(xiàn)目的代謝活性的提高這一預(yù)期目標(biāo)的一個嶄新的領(lǐng)域。 代謝工程中的遺傳手段可以采用基因工程技術(shù)，也可以采用常規(guī)誘變育種技術(shù)，但前者有機會引進外源基因和外源調(diào)節(jié)因子，這同傳統(tǒng)的改良菌種的遺傳方法不同。 代謝工程的實質(zhì)： 對代謝流量及其控制進行定量分析的方法與用來實現(xiàn)預(yù)期的遺傳修飾的分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合 代謝工程所要解決的問題是什么呢？ 代謝工程要解決的主要問題： 改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布 典型目標(biāo)是： 修飾初級或次級代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的理想載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率 具體表現(xiàn)為： ① 提高細(xì)胞現(xiàn)存代謝途徑中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量； ② 改造細(xì)胞現(xiàn)存代謝途徑 ，使其合成新產(chǎn)物 ， 這種新產(chǎn)物可以使中間代謝產(chǎn)物或修飾型的最終產(chǎn)物； ③ 對不同細(xì)胞的代謝途徑進行擬合 ，構(gòu)建全新的代謝通路 ， 從而產(chǎn)生細(xì)胞自身不能合成的新產(chǎn)物； ④ 優(yōu)化細(xì)胞的生物學(xué)特性 ， 如生長速率 、 某些極端環(huán)境條件的耐受性等 。 代謝工程關(guān)注的最多的 是代謝途徑的組合而非單一的反應(yīng)。 代謝工程的精髓 在于其從傳統(tǒng)的單一酶促反應(yīng)分析向相互作用的生化反應(yīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，更強調(diào)了代謝網(wǎng)絡(luò)的概念，也只有這樣，生物體代謝活動