【正文】 理論數(shù) 實(shí)際數(shù) 克隆片段 的平均 大小（ bp） 5 103 400 1831 4000 18 418 600 000 27 631 109 10 103 200 919 2022 9 208 300 000 1 381 550 20 103 100 458 1000 4 603 150 000 690 774 40 103 50 278 500 2 300 75 000 354 386 從基因組文庫(kù)中釣取 因?yàn)榛蚪M DNA片段是隨即克隆的，所以基因組大小除以克隆片段大小得到的只是 克隆數(shù)的理論值 ，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度分析，從這個(gè)理論克隆數(shù)中克隆到特定基因片段的幾率只有50%。所以為了達(dá)到一種合理的幾率以克隆到目的基因， 一個(gè)完整的基因組文庫(kù)就必須含有 310倍于最低重組克隆數(shù)的克隆。其中， N代表實(shí)際克隆數(shù)； p代表在重組群體中出現(xiàn)特定基因的幾率（一般的期望值都為 99%）； f代表限制性片段的平均大小與相應(yīng)生物體基因組大小的比值。不僅是因?yàn)樗鼈兪?4堿基識(shí)別位點(diǎn)的酶，而且它們和BamHI是同尾酶。 克隆真核生物的基因往往是從 cDNA文庫(kù)的建立開(kāi)始的。 A. 文庫(kù)的構(gòu)建 5’ TTTTTTTTT DNA聚合酶I 從 cDNA文庫(kù)中釣取目的基因 3’ AAAAAAAA AAAAAAAA 5’ TTTTTTTTT 3’ AAAAAAAA 多聚 T引物 反轉(zhuǎn)錄酶 AAAAAAAA TTTTTTTTT 堿降解 RNA S1核酸酶 加接頭 插入載體并 導(dǎo)入寄主細(xì)胞 重組克隆 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程 A. 文庫(kù)的構(gòu)建 A. 文庫(kù)的構(gòu)建 構(gòu)建好文庫(kù)后就需要從眾多的克隆中篩選出含有目的 DNA片段的克隆 , 這時(shí)一般要用到菌落原位雜交技術(shù) . 如果兩條同原性很高的 DNA序列解鏈后混合 , 當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)來(lái)源于不同的 DNA的單鏈間可以通過(guò)堿基互補(bǔ)而發(fā)生緊密結(jié)合 （ 雜交 ） 。 用同位素標(biāo)記后可以通過(guò) X光片的 感光來(lái)探測(cè)到有雜交信 號(hào)的克隆 ， 用地高辛標(biāo) 記后可以通過(guò)結(jié)合在抗 地高辛抗體上的堿性磷 酸酶與顯色底物的反應(yīng) 直接觀察到發(fā)生了雜交 的克隆 （ 對(duì)應(yīng)位置顯為 紫色 ） 。 b. 用堿處理使的細(xì)胞中的 DNA釋放出來(lái)并且發(fā)生解鏈 。 菌落原位雜交的基本流程是： B. 克隆的篩選 d. 將轉(zhuǎn)好的膜在含有探針的雜交液中雜交 ， 使得探針與目標(biāo) DNA緊密結(jié)合 。 e. 探針為地高辛標(biāo)記時(shí) ， 可以通過(guò)抗體和地高辛的二次雜交和顯色反應(yīng)在含有特定 DNA片段的克隆對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)紫色印記 。 C. 目標(biāo) DNA片段的獲得 一般來(lái)說(shuō)將篩選到的克隆提取其中質(zhì)粒 DNA， 通過(guò)酶切就可以獲得所要的目標(biāo) DNA片段 。 比如 ， 我們可以將克隆到的 DNA片段用某一種或幾中限制性內(nèi)切酶消化 ， 再通過(guò)電泳將不同分子的 DNA分開(kāi) ， 然后通過(guò)毛細(xì)管法將 DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到尼龍膜上 ， 最后用探針雜交以確定含有特定片段的目的 DNA片段 。如果該基因很大是，可以分段進(jìn)行克隆，然后再將獲得的片段連接起來(lái)，最終得到目的基因的全序列。這時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀質(zhì)粒 DNA、多聚核糖體、可溶性蛋 c. 白質(zhì)等生物大分子放出來(lái)，而核 染色體仍然附著在細(xì)胞的碎片上。 e. 用酚、酚 /氯仿 /異戊醇處理去除上 清液中的蛋白質(zhì)，最終獲得質(zhì)粒。當(dāng)然，通過(guò)同尾酶切割后的 DNA片段也具有這種特性。 C. 如果是要求實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的序列，還要注意轉(zhuǎn)錄和翻譯的密碼子結(jié)構(gòu)的正確性。 目的基因與載體的連接 載體去磷防止連接反應(yīng)中的載體自連 P OH P OH OH OH OH OH P OH P OH OH OH OH OH 連接酶 連接酶 連接酶 堿性磷酸酶 2Pi 寄主修復(fù)缺口 載體自連或產(chǎn)生二具體等 目的基因與載體的連接 外源 DNA片段的定向插入 當(dāng)兩個(gè)末端具有相同得粘性末端的 DNA分子或是平末端的DNA分子插入到載體中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)正向和反向插入兩種情況。 目的基因與載體的連接 HindIII BamHI HindIII BamHI HindIII BamHI 平末端 DNA片段加接頭 在實(shí)際操作中，往往會(huì)出現(xiàn)找不到合適酶切位點(diǎn)，或是所產(chǎn)生的外源 DNA只能是平末端的情況，這時(shí)就需要對(duì)平末端的DNA分子進(jìn)行連接。 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC 磷酸化 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH OH P P P OH OH T4連接酶 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH P OH EcoR I CCGAATTCGG GGCTTAAGCC AATTCGG GCC CCG GGCTTAA 目的基因與載體的連接 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶 和 T4DNA連接酶 平末端 DNA片段末端加尾法連接 目的基因與載體的連接 第二節(jié) 重組載體的構(gòu)建及細(xì)菌轉(zhuǎn)化 載體的選擇和分離 目的基因與載體的連接 重組載體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入 重組載體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入 重組 DNA分子構(gòu)建好后必須轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能得到擴(kuò)增和表達(dá) 。 將具有感染能力的噬菌體 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為 轉(zhuǎn)染 （ transfection） ；而噬菌體主動(dòng)將其 DNA注入受體細(xì)胞得過(guò)程稱為 感染（ infection） . 1970年 ， Mandel和 Higa等發(fā)現(xiàn) ， 用 CaCl2 溶液處理過(guò)的大腸桿菌細(xì)胞比較容易獲得 ?噬菌體的 DNA； 1972年 ，Cohen等也發(fā)現(xiàn)用 CaCl2 溶液處理過(guò)的大腸桿菌能被環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA分子所轉(zhuǎn)化 。 d) 將細(xì)菌沉淀用 5mL 預(yù)冷的 CaCl2（ ）重懸，冰浴一會(huì)后于 4 ℃ 4000rpm離心 10分鐘； e) 將細(xì)菌沉淀用 1mL 預(yù)冷的 CaCl2（ ）重懸，取 200uL用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化 ,其余菌液加入 20%的無(wú)菌甘油 ,搖勻后于 20℃ 保存?zhèn)溆?。 d) 加入 800uL的 LB培養(yǎng)基 ,混勻后于 37℃ 水浴 5分鐘 ； e) 將離心管側(cè)向固定在搖床上 ,37℃ 緩慢震蕩培養(yǎng) 45分鐘 。 g) 檢測(cè)選擇平板上的抗性菌落 ,并提取質(zhì)粒 DNA進(jìn)行鑒定 . 第四章 基因克隆的策略 引 言 第一節(jié) 目的基因的獲得 第二節(jié) 重組體的構(gòu)建及細(xì)菌轉(zhuǎn)化 第三節(jié) 重組克隆的篩選和鑒定 第三節(jié) 重組克隆的篩選和鑒定 根據(jù)所使用克隆載體的特性不同 ， 重組克隆的篩選方法也多種多樣 。 比如 ， 從平板上隨機(jī)挑選 10個(gè)菌落 ， 然后提取其中的質(zhì)粒 DNA分子 ， 并對(duì)其進(jìn)行酶切分析 ， 同樣可以準(zhǔn)確地選擇得到所要的重組克隆 ， 而且同時(shí)可以鑒定外源片段插入的方向 ， 選擇得到所要的理想克隆 。 這時(shí)我們可以用比較復(fù)雜的 核酸雜交或免疫化學(xué)的方法